Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Recettore e Attenua Segnalazione a valle (2013)

Citazione: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Phosphorylates Cdk5 Dopamina D2 Recettore e Attenua Segnalazione a valle. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Università del Nord Dakota, Stati Uniti d'America

Ricevuto: Può 20, 2013; Accettato: Novembre 14, 2013; Pubblicato il: Dicembre 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito secondo i termini del Creative Commons Attribution License, che consente l'uso, la distribuzione e la riproduzione illimitati su qualsiasi supporto, a condizione che l'autore e la fonte originali siano accreditati.

finanziamento: Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni (NRF-2012R1A2A2A01012923 e NRF-2012R1A4A1028200) dal governo coreano (MSIP) e anche sostenuto nell'ambito del programma di cooperazione internazionale gestito da NRF della Corea (2012K2A1A2033117) e dal Korea Brain Research Institute (KBRI) Programma di ricerca di base di MSIP (2031-415). SKP ha ricevuto il premio 2004 e 2006 National Alliance for Research su Schizophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Interessi conflittuali: Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione.

Introduzione

La segnalazione della dopamina è coinvolta in varie funzioni del cervello, tra cui la coordinazione motoria, il controllo dell'umore e meccanismi di ricompensa [1]. Un importante componente del segnale della dopamina nei vertebrati è esercitato dai neuroni striatali medio-spinosi (MSN) che esprimono selettivamente un sottogruppo di recettori dopaminergici e ricevono input dopaminergici principalmente dall'area tegmentale ventrale (VTA) e dalla sostanza nera (SN)) [2]. I recettori della dopamina sono recettori accoppiati a proteine ​​G (GPCR) con sette domini transmembrana e consistono in due sottotipi, Recettori D1-like e D2-like, che mediano le azioni reciproche nella segnalazione della dopamina [1]. Ad esempio, i recettori simili alla D1 della dopamina (D1, D5) attivano l'adenilil ciclasi attraverso G_αs e aumentare il livello intracellulare di cAMP, ma i recettori simili alla D2 della dopamina (D2, D3, D4) inibiscono l'adenililciclasi attraverso G_αi e ridurre il livello intracellulare di cAMP [1], [3].

Tra i recettori della dopamina, il recettore D2 (DRD2) è implicato nella patofisiologia di più importanti disturbi psichiatrici tra cui la schizofrenia e la tossicodipendenza [4], tale che molti farmaci antipsicotici mirano almeno parzialmente a DRD2. È anche noto che l'attività DRD2 è correlata bene con le conseguenze comportamentali delle droghe d'abuso nei modelli animali [5]. Gli antidepressivi e l'efficacia dello stabilizzatore dell'umore sono stati anche collegati alle alterazioni dell'espressione della superficie cellulare di DRD2 o alla segnalazione intracellulare a valle mediata da PKA, ERK e GSK3 [1], [4], [6]. Nonostante questi ruoli critici per DRD2 nel cervello, i meccanismi regolatori dettagliati che conferiscono eterogeneità e complessità alle proprietà DRD2 non sono completamente compresi.

Linee di evidenza convergenti indicano che sono coinvolte molteplici modifiche post-traduzionali nella messa a punto dell'attività di DRD2. Ampia glicosilazione di DRD2 è stata rivelata in studi di etichettatura di foto-affinità precoci [7]e la formazione del legame disolfuro all'interno di DRD2 è stata anche identificata come una modifica importante per il legame del ligando [8]. Inoltre, i siti di fosforilazione di DRD2 sono stati identificati inizialmente da in vitro saggio con radioisotopi, fornendo percorsi per vari percorsi regolatori mediati da varie chinasi [9]. Infatti, la protein chinasi C (PKC) regola la mobilizzazione mediata da DRD2 del calcio intracellulare e modula l'interazione di DRD2 con le proteine ​​del citoscheletro [10]. La fosforilazione della chinasi GPCR 2 (GRK2) regola i pattern di resensitizzazione indotta dall'agonista di DRD2 [11].

Chinasi Cyclin-dipendente 5 (Cdk5) è una serina / treonina chinasi prolina-diretta che ha un'attività preferenziale a causa dell'espressione specifica del cervello dei suoi attivatori essenziali, p35 e p39 [12]. Cdk5 è coinvolto in vari processi neuronali tra cui la migrazione neuronale e la guida degli assoni, e Cdk5 e p35 null topi mostrano difetti nella stratificazione corticale [13]. Recentemente, è stato dimostrato che la fosforilazione di WAVE1 ed ephexin da parte di Cdk5 regola la morfogenesi della colonna vertebrale [14]. Inoltre, Cdk5 regola anche i livelli di espressione superficiale del recettore NMDA, NR2B e le correnti NMDA mediate da NR2A [15], [16]. È interessante notare che prove multiple suggeriscono una relazione intima tra Cdk5 e il sistema della dopamina. Cdk5 fosforila la tirosina idrossilasi (TH), regolandone la stabilità e mantenendo così l'omeostasi dopaminergica [17]. Nei neuroni postsinaptici, quando il residuo di T75 di fosfoproteina regolata da dopamina e ciclico-AMP-32kD (DARPP-32) è fosforilata da Cdk5, può inibire l'attività di PKA e quindi antagonizzare la PKA segnalata dalla dopamina DRD1-mediata [18]. È interessante notare che quando la cocaina, un agonista indiretto dei recettori della dopamina, viene somministrata cronicamente nei ratti, i livelli di mRNA e di proteine ​​di Cdk5 aumentano nei neuroni spinosi medi [19]. Collettivamente, Cdk5 sembra essere coinvolto in adattamenti sinaptici indotti da farmaci. In questo studio, mostriamo un'interazione funzionale di DRD2 e Cdk5 che estende ulteriormente il ruolo di Cdk5 nella segnalazione di dopamina.

Materiali e Metodi

Anticorpi

Siero anti-coniglio sono stati sollevati contro peptidi contenenti fosfo-serina 321 (pS321) del terzo ciclo intracellulare di DRD2 (D2i3). Il fosfo-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), è stato utilizzato per creare una colonna coniugata con peptidi per purificazione di affinità (20401, PIERCE). L'anticorpo anti-pS321 è stato arricchito da un sistema di purificazione per affinità seguendo le istruzioni del produttore. Il fosfo-anticorpo purificato è stato conservato in PBS con 0.1% di sodio azide e 0.1% di gelatina. Anticorpo anti-topo anti-Cdk5 (sc-249) e anticorpo anti-coniglio anti-p35 (sc-820) sono stati usati per il Western blotting e l'immunocitochimica di Cdk5 / p35. Anticorpo anti-topo anti-GFP (sc-9996) è stato usato per l'immunoprecipitazione e Western blotting di DRD2-GFP. Anticorpo anti-FLAG anti-coniglio (sc-807), anticorpo anti-HA anti-coniglio (sc-805), anticorpo anti-topo anti-GST (sc-138) e anticorpo anti-topo anti-GAPDH (sc- 32293) sono stati acquistati da Biotecnologie di Santa Cruz.

Animali

Il mouse knockout p35 è stato un regalo gentile dal Dr. Katsuhiko Mikoshiba presso il RIKEN Brain Science Institute in Giappone e utilizzato per la coltura dei neuroni primari. I set di primer per la genotipizzazione erano 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC e 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT come precedentemente descritto [20]. Topi ICR e ratti Sprague Dawley sono stati utilizzati per la preparazione del lisato di cervello. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per l'uso e la cura degli animali in Istituzioni della scienza e della tecnologia dell'Università di Pohang.

Costrutti di plasmidi

L'isoforma lunga DRD2 umana in un vettore plasmide EGFP-N1 e il terzo ciclo intracellulare di DRD2 (residui di amminoacidi 212-373 inclusi i residui di amminoacidi 29 aggiuntivi esclusivi dell'isoforma lunga DRD2) in un vettore plasmide pFLAG-CMV-2 sono stati utilizzati. Human Cdk5 è stato inserito in un vettore plasmide pCMV-HA e p35 umano è stato inserito in un vettore plasmide 3.1 di pcDNA. Human Cdk5 è stato inserito sotto un promotore del citomegalovirus (CMV) insieme a p35 umano in un vettore 3.1 di pcDNA per creare un costrutto a doppia espressione (Cdk5 / p35) per immunocitochimica, test di internalizzazione del recettore, [³⁵S] -GTP_γS saggio di legame, saggio di legame radioligando e saggio immunoenzimatico di cAMP.

In Vitro Test della chinasi

IP-linked in vitro l'analisi della chinasi è stata eseguita come segue. Un cervello di topo intero è stato lisato in 3 mL eritrociti tampone di lisi (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) mediante colpi 20 di un omogeneizzatore Dounce per ottenere lisati cerebrali omogeneizzati . I lisati sono stati incubati su ghiaccio per 30 min, sonicati e centrifugati a 16,000 × g per 10 min. I surnatanti sono stati immunoprecipitati con anticorpi anti-p35 anti-coniglio per ottenere un complesso attivo Cdk5 / p35. La proteina di fusione GST complessa e purificata Cdk5 / p35 è stata miscelata con adenosina 5'-trifosfato, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) e incubato in tampone chinasi (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) per 1 h a temperatura ambiente [18], [21]. Anche il complesso Cdk5 / p25 purificato (14-516, Millipore) è stato utilizzato per in vitro saggio di chinasi come descritto sopra. Il tampone di caricamento del campione 2 × è stato aggiunto alla miscela di reazione e fatto bollire a 100 ° C. I campioni sono stati quindi sottoposti a SDS-PAGE e il gel essiccato è stato valutato mediante autoradiografia.

Liquid Chromatography (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Analysis

La proteina ricombinante GST-D2i3 è stata analizzata da LC-MS / MS in seguito a legame IP in vitro saggio della chinasi. Abbiamo eseguito l'identificazione del peptide dei dati LC-MS / MS utilizzando X !! Tandem (versione Dec-01-2008). Ogni file di dati RAW è stato prima convertito in mzXML usando la pipeline trans-proteomica (TPP; versione 4.3). Le scansioni MS / MS negli mzXML convertiti sono state quindi sottoposte a ricerche nel database delle sequenze di proteine ​​del mouse UniProt (versione 2010_07) inclusa la sequenza GST-D2i3 utilizzando X !! Tandem. La tolleranza è stata impostata su 3 Da per gli ioni precursori e 2 Da per gli ioni frammento. È stata utilizzata la specificità enzimatica per tripsina. Le opzioni di modifica variabile sono state utilizzate per la carbamidometilazione di cisteina (57.021 Da), l'ossidazione della metionina (15.995 Da), l'idrolisi dell'asparagina (0.987 Da) e la fosforilazione della serina (79.966 Da).

immunoprecipitazione

Immunoprecipitazione è stata eseguita su lisati cellulari nel tampone di lisi ELB. L'anticorpo anti-GFP è stato aggiunto ai lisati e incubato per 3 h a 4 ° C. Gli immunocomplessi sono stati purificati utilizzando l'agarosio proteico-A. I precipitati sono stati incubati con tampone di caricamento del campione SDS per 30 min a 37 ° C e sottoposti a SDS-PAGE e Western blot.

GST Pull-down Assay

10 μg di GST purificato e GST-D2i3 sono stati incubati con lisato di cervello di ratto per 1.5 h a 4 ° C. 30 μL di perline Sepharose 4B con glutatione (GSH) (17-0756-01, GE Healthcare) equilibrate con tampone di lisi sono state aggiunte e incubate per 1 h aggiuntivo. Le perle sono state raccolte mediante centrifugazione su 2,000 ×g e risciacquato con tempi di tampone di lisi 4 [22], [23]. I precipitati sono stati analizzati mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-Cdk5 e anti-p35.

immunocitochimica

Cellule transfected HEN 293 e neuroni striatali coltivati ​​su vetrini sono stati lavati una volta con tampone fosfato salino (PBS) e fissati per immersione in freddo 4% paraformaldeide / PBS per 30 min. L'anticorpo primario è stato diluito nella soluzione bloccante (siero di cavallo 2% e 1% Triton X-100 in PBS). Anticorpi secondari anti-topo coniugati con Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) e anti-coniglio coniugato con Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) sono stati utilizzati come anticorpi secondari. Hoechst è stato utilizzato per la colorazione del nucleo. Le immagini sono state ottenute con microscopia confocale (Olympus, FluoView-1000).

Test di internalizzazione del recettore

24 h dopo trasfezione, le cellule sono state trattate con 1 μM quinpirolo (Q102, Sigma) per 30 min e 90 min a 37 ° C. Le cellule sono state risospese in 2 mL cold PBS e sono state utilizzate aliquote 200 μL per ciascuna reazione. I trattamenti farmacologici sono stati effettuati a temperatura ambiente per 3 h alle seguenti concentrazioni; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM aloperidolo (H1512, Sigma). Idrofobo [³H] -spiperone è stato utilizzato per etichettare i recettori espressi totali e il sulpiride idrofilo è stato usato per sostituire il legame del recettore membranoso [³H] -spiperone segnali. I segnali dei recettori associati alla membrana sono stati calcolati sottraendo i valori dei recettori intracellulari dai valori dei recettori totali espressi. Le cellule sono state filtrate su un filtro GF / B (Millipore) e lavate 3 volte con tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). I filtri sono stati asciugati e la radioattività residua è stata misurata utilizzando un contatore a scintillazione liquida [24].

Preparazione della membrana cellulare

Le cellule confluenti nei piatti di coltura 100 mm dopo trasfezione sono state lavate con PBS ghiacciato e raccolte in 1 mL tampone HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). I lisati omogeneizzati sono stati centrifugati con 500 × g per 15 min ei surnatanti sono stati successivamente centrifugati con 36,000 × g per 30 min. Per il dosaggio sono stati utilizzati pellet ri-sospesi in tampone HME.

[³⁵S] -GTP_γS Binding Assay

Le frazioni della membrana cellulare sono state pre-incubate con 1 μM quinpirolo (Q102, Sigma) nel tampone del test (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0.01 mM PIL) per 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) è stato aggiunto alla concentrazione finale di 3 nM in 30 μL e ulteriormente incubato per 90 min. 170 μL di tampone gelido (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂e 0.1 mM GTP) è stato aggiunto per fermare la reazione. Le membrane sono state filtrate su un filtro GF / B (Millipore) e lavate con 3 volte con tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). I filtri sono stati essiccati e la radioattività è stata misurata utilizzando il contatore di scintillazione [25], [26].

Saggio di legame radioligante

Le membrane cellulari preparate sono state incubate con 0.01 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) e concentrazioni crescenti di quinpirolo (Q102, Sigma) per 30 min nel tampone del saggio (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Le membrane sono state filtrate su un filtro GF / B (Millipore) e lavate con 3 volte con tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). La reazione è stata terminata mediante filtrazione rapida attraverso filtri GF / C. La radioattività residua è stata misurata utilizzando un contatore a scintillazione liquida [27]-[29].

Immunoassay enzimatico cAMP

Le cellule transfected HEK 293 sono state pretrattate con 10 μM rolipram (R6520, Sigma) per 1 h e quindi trattate con 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) e con concentrazioni crescenti di quinpirolo (Q102, Sigma) per 30 min. I neuroni striatali da coltura primaria sono stati trattati con 10 μM rolipram per 1 h, e poi 1 μM dopamina per 1 h [22]. I lisati cellulari sono stati preparati con 0.1 M HCl e i livelli di cAMP sono stati rilevati dal kit immunodosaggio enzimatico cAMP (Sapphire Bioscience) seguendo le istruzioni del produttore.

Neurone Striatale Colto Primario

L'area striatale era isolata dal cervello embrionale del mouse (E15). Il tessuto dissecato è stato dissociato in minima sostanza essenziale (MEM) (11095, Invitrogen) contenente 0.25% tripsina (T4549-100, Sigma) e 0.1% DNasi I per 6 min a 37 ° C. Le cellule sono state risospese nel mezzo di placcatura (MEM con 0.01 M HEPES (pH 7.4) e 10% (vol / vol) siero di cavallo (16050-122, GIBCO)). I neuroni sono stati coltivati ​​per i giorni 7 in vitro (DIV 7) in MEM con supplemento B27 (17504-044, Invitrogen) prima di essere applicato a immunodosaggi enzimatici cAMP.

Risultati

Cdk5 fosforilati Serina 321 nel terzo anello intracellulare di DRD2 in vitro

Per identificare nuovi substrati Cdk5, abbiamo eseguito una ricerca sistematica usando (S / T) PX (K / H / R) come sequenze di consenso al riconoscimento Cdk5 [30] e identificato DRD2 come substrato candidato. La sequenza di consenso, inclusa la serina 321, si trova nel terzo anello intracellulare di DRD2 (D2i3) in cui sono implicati vari meccanismi di regolazione [3], [10], [11]. La sequenza è evolutivamente conservata in DRD2 nei vertebrati, implicando un'importanza funzionale del residuo (Fig. 1A).

Per valutare la capacità di Cdk5 di fosforilare D2i3, abbiamo eseguito il collegamento IP in vitro saggi di chinasi utilizzando un complesso attivo Cdk5 / p35 arricchito da lisato di cervello di topo mediante immunoprecipitazione di p35 con proteine ​​GST-D2i3 purificate (residui di aminoacidi 212-373) come substrati. Abbiamo osservato i segnali di fosforilazione nelle proteine ​​GST-D2i3 e GST-D2i3 S297A purificate, ma il segnale è stato significativamente ridotto utilizzando GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Per verificare ulteriormente la fosforilazione della serina 321 nel GST-D2i3, abbiamo eseguito l'analisi LC-MS / MS dei campioni da IP-linked in vitro analisi della chinasi mediante spettrometria di massa LTQ XL. Coerentemente, sono stati recuperati i fosfo-peptidi corrispondenti alla massa dei peptidi 321 fosfo-sierici (Fig. 1C). Considerando che l'acquisizione dipendente dai dati durante l'analisi LC-MS / MS tende a rilevare abbondanti proteine ​​nel campione [31], questi dati suggeriscono che il residuo 321 della serina è il sito di fosforilazione dominante di Cdk5 nella regione D2i3. Per dimostrare la fosforilazione diretta della serina 321 nel GST-D2i3 di Cdk5, in vitro è stato eseguito il dosaggio della chinasi utilizzando il complesso purificato Cdk5 / GST-p25 con proteine ​​GST-D2i3 ricombinanti purificate. Abbiamo identificato un significativo segnale di fosforilazione nel GST-D2i3 che era assente nel GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Presi insieme, questi risultati indicano che il residuo D2i3 S321 è un bersaglio preferenziale per la fosforilazione mediata da Cdk5.

Cdk5 fosforilati Serina 321 nel terzo anello intracellulare di DRD2 nelle cellule

Per identificare la fosforilazione della serina 321, abbiamo sollevato anticorpi specifici per fosfo-serina 321 (pS321). Campioni dal collegamento IP in vitro l'analisi della chinasi è stata analizzata mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-pS321. Le macchie hanno mostrato una banda distinta nella reazione della chinasi che dipendeva da GST-D2i3 (Fig. 2A). Per verificare la potenziale fosforilazione di serina 321 in DRD2 da Cdk5 in cellule, immunoprecipitati di anti-GFP da cellule HEN 293 che esprimono DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP con o senza HA-Cdk5 e p35 sono stati analizzati mediante Western blotting usando anti-GFP e anticorpi anti-pS321. I segnali caratteristici della banda spalmata dall'anticorpo anti-GFP che sono noti a causa dell'eccessiva glicosilazione di DRD2 sono osservati solo in presenza di DRD2-GFP, e l'anticorpo anti-pS321 ha rilevato segnali DRD2 simili solo con Cdk5 / p35 co espressione (Fig. 2B) [7]. Per verificare ulteriormente la fosforilazione della serina 321 da Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) e la forma mutante di D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) sono stati generati. FLAG-D2i3 e FLAG-D2i3 S321A espressi con o senza HA-Cdk5 e p35 nelle cellule HEN 293 sono stati analizzati mediante un test di spostamento della mobilità SDS-gel. È stato osservato un significativo spostamento della mobilità dipendente da Cdk5 per FLAG-D2i3, ma non per FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Abbiamo anche valutato il livello di fosforilazione di DRD2 a Ser321 dopo stimolazione con agonisti. Le cellule HEK 293 che esprimono il complesso DRD2-GFP e Cdk5 / p35 sono state stimolate dal quinpirolo e gli immunoprecipitati anti-GFP dai lisati cellulari sono stati analizzati mediante Western blotting utilizzando anticorpi anti-GFP e anti-pS321. Abbiamo trovato che la fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 a Ser321 non era influenzata dalla stimolazione agonista, che appare diversa dalle fosforilazioni mediate da GRK e PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Insieme, questi risultati indicano che Cdk5 può fosforilare il residuo 321 della serina di DRD2 nell'ambiente cellulare.

Cdk5 / p35 Complex e DRD2 sono associati fisicamente

Abbiamo studiato la potenziale interazione fisica tra il complesso Cdk5 / p35 e DRD2 perché è noto che molti substrati Cdk5 sono fisicamente associati al complesso Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Innanzitutto, è stato eseguito l'esperimento di pull-down GST. La proteina GST-D2i3 ricombinante purificata è stata incubata con lisato di cervello di ratto e i precipitati di pull-down GST sono stati analizzati per Western blotting. Come mostrato in Fig. 3A, Cdk5 endogeno e p35 sono stati identificati nei precipitati pull-down, indicando un'interazione fisica tra DRD2 e il complesso Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Inoltre, HA-Cdk5 e p35 sono stati rilevati negli immunoprecipitati anti-GFP dai lisati di cellule HEN 293 che esprimono DRD2-GFP e Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Inoltre, abbiamo eseguito analisi immunocitochimiche e osservato che DRD2-GFP, HA-Cdk5 e p35 mostrano significativi segnali di co-localizzazione nell'area membranosa delle cellule HEK 293 (Fig. 3C, pannelli superiori). Abbiamo anche studiato la co-localizzazione di DRD2 e Cdk5 / p35 nel contesto neuronale. Coerentemente, DRD2-GFP ha anche mostrato una significativa co-localizzazione con Cdk5 endogeno e p35 nei neuroni striatali coltivati ​​(DIV7), supportando ulteriormente i collegamenti funzionali tra DRD2 e Cdk5 / p35 (Fig. 3C, pannelli inferiori). I risultati indicano che DRD2 e Cdk5 / p35 possono formare un complesso e, quindi, supportare l'idea che DRD2 sia un substrato fisiologico di Cdk5.

La fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 attenua l'attività dei recettori

È stato riportato che la fosforilazione modula le proprietà critiche dei GPCR come l'accoppiamento della proteina G, l'internalizzazione del recettore, la localizzazione intracellulare e l'associazione con proteine ​​modulatrici [9], [11], [24]. UNL'internalizzazione del recettore indotta da gonisti è un processo regolatore critico della trasduzione del segnale. Abbiamo studiato la modulazione mediata da Cdk5 dell'internalizzazione DRD2. Le cellule HEK 293 che esprimono DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP con o senza Cdk5 / p35 sono state incubate con 1 μM quinpirolo per indurre l'internalizzazione DRD2 stimolata da agonisti (Fig. 4A). [³I segnali H] -spiperone delle cellule esprimenti DRD2-GFP sono stati significativamente ridotti al trattamento con 30 min quinpirolo e recuperati a 90 min. È interessante notare che [³I segnali H] -spiperone delle cellule esprimenti DRD2-GFP e Cdk5 / p35 sono stati ridotti al trattamento con 30 min quinpirolo ma non sono stati recuperati a 90 min (Fig. 4A, seconda sezione). D'altro canto, [³I segnali H] -spiperone delle cellule esprimenti DRD2 S321A-GFP sono stati ridotti a 30 min e recuperati a 90 min, indipendentemente dalla co-espressione con Cdk5 / p35. Precedenti studi hanno dimostrato che il DRD2 internalizzato ricicla alla membrana plasmatica in seguito a stimolazione prolungata di agonisti [11]. TSembra che la fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 sia coinvolta nei processi di resisitizzazione dopo l'internalizzazione DRD2 indotta da agonista.

Abbiamo inoltre valutato un potenziale cambiamento di accoppiamento della proteina G stimolata da agonisti a DRD2 associato alla fosforilazione mediata da Cdk5 utilizzando [³⁵S] -GTP_γS saggio di legame [25], [26]. DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP con o senza Cdk5 / p35 erano espressi in celle HEK 293. Le membrane sono state preparate e stimolate con 1 μM quinpirolo e ulteriormente permesso [³⁵S] -GTP_γIncorporazione di S. La membrana cellulare che esprime DRD2-GFP e Cdk5 / p35 ha mostrato una compromissione significativa [³⁵S] -GTP_γLegatura S rispetto a tutte le altre membrane cellulari (Fig. 4B). Questi risultati indicano che la fosforilazione mediata da Cdk5 down-regola il legame alle proteine ​​G stimolate da agonisti a DRD2.

Inoltre, quinpirole-competing [³Sono stati eseguiti saggi di legame H -spiperone per studiare qualsiasi potenziale variazione nell'affinità di agonista a DRD2 mediante fosforilazione mediata da Cdk5. Vincolo competitivo di [³H] -spiperone dopo trattamento di concentrazioni crescenti di quinpirolo alla preparazione della membrana da transfected è stato misurato. Associazione vincolante di quinpirole e [³H] -spiperone a DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP fatto simile logK_i valori (-9.789 per DRD2-GFP; -9.691 per DRD2 S321A-GFP), indicando che l'affinità del ligando con DRD2 non è significativamente influenzata dalla fosforilazione mediata da Cdk5 in DRD2 (Fig. 4C).

La fosforilazione mediata da Cdk5 down-regola la via di segnalazione DRD2-cAMP

Successivamente, abbiamo esaminato se la modifica di DRD2 da parte di Cdk5 influenzi le vie di segnalazione a valle. Abbiamo monitorato l'inibizione mediata da DRD2 della produzione di cAMP stimolata con forskolina mediante adenililciclasi nelle cellule che esprimono DRD2-GFP e DRD2 S321A-GFP utilizzando il saggio immunologico enzimatico cAMP. Le cellule che esprimono DRD2 hanno mostrato una diminuzione dei livelli di cAMP in risposta al quinpirolo in modo dose-dipendente. Sorprendentemente, la co-espressione di Cdk5 / p35 ha ridotto significativamente la massima inibizione della formazione di cAMP (Fig. 4D, pannello a sinistra). D'altra parte, nelle cellule esprimenti DRD2 S321A-GFP, le formazioni di cAMP sono state effettivamente inibite in risposta al trattamento con quinpirolo indipendentemente dall'espressione di Cdk5 / p35 (Fig. 4D, pannello destro). Questi risultati indicano che la fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 attenua l'attività inibitoria di DRD2 sulla via di segnalazione del cAMP a valle. Per confermare ulteriormente i fenomeni in un ambiente più fisiologicamente rilevante, abbiamo fatto uso di neuroni coltivati ​​primari da embrioni knockout carenti di p35, un attivatore essenziale di Cdk5. I neuroni striatali primari colti sono stati trattati con 1 μM dopamina e analizzati mediante immunodosaggio enzimatico cAMP. I neuroni dei topi knockout p35 hanno mostrato livelli ridotti di cAMP rispetto ai neuroni wild-type quando stimolati con dopamina (Fig. 4E). Tinsieme, abbiamo concluso che la fosforilazione mediata da Cdk5 di DRD2 si traduce in una diminuzione del tono inibitorio sulla via cAMP esercitata da DRD2.

Discussione

Abbiamo identificato DRD2 come un nuovo substrato di Cdk5. La fosforilazione sembra down-regola l'espressione della superficie DRD2 influenzando il destino di DRD2 dopo l'internalizzazione del recettore riducendo quindi DRD2 G_i-accoppiamento e percorso cAMP a valle. Poiché il residuo di fosforilazione S321 esiste sia nelle isoforme lunghe e corte DRD2, il meccanismo proposto in questo studio può essere una modalità generale di regolazione nella segnalazione mediata da DRD2.

DRD2 nei neuroni spinosi medi non solo è stato considerato come un sottotipo dei recettori della dopamina, ma è stato anche riconosciuto per la sua suscettibilità ai cambiamenti di disponibilità in risposta agli stimoli ambientali. La desensibilizzazione e la risensibilizzazione indotte da agonisti di DRD2 sono state ampiamente studiate [11], [24]. In particolare, un certo numero di studi ha dimostrato che gli effetti dell'esposizione cronica di psicostimolante, come cocaina e anfetamina, che innalzano il livello extracellulare di dopamina nella sinapsi striatale, sono accompagnati da cambiamenti dinamici di DRD2 postsinapticamente [36]. Infatti, gli utilizzatori di cocaina cronica sono noti per aver ridotto i livelli di DRD2 nell'area striatale e la disponibilità di DRD2 nel nucleus accumbens (NAcc) mostra una correlazione negativa con i comportamenti di ricerca e rinforzo dei farmaci nei topi e nei primati [37]-[39]. Questi risultati indicano che la funzionalità di DRD2 è altamente suscettibile alla regolazione adattativa o compensativa in risposta a vari stimoli inclusa l'esposizione cronica al farmaco. I nostri risultati mostrano che il residuo S321 nel terzo ciclo intracellulare di DRD2 può essere fosforilato da Cdk5, il che si traduce in una diminuzione dell'influenza inibitoria di DRD2 sulla via del cAMP. Questa interazione propone un nuovo meccanismo di regolazione associato a Cdk5 nei neuroni dopaminocettivi che potrebbe essere collegato alla natura dinamica della disponibilità di superfici DRD2.

Va notato che Cdk5 è noto per essere un componente chiave nella mediazione dei cambiamenti adattativi dell'ambiente neuronale. Ad esempio, le alterazioni strutturali e funzionali delle spine dendritiche nei neuroni del circuito limbico sono una delle conseguenze dell'esposizione ripetuta a uno psicostimolante [40]. Questi cambiamenti sono accompagnati da vari cambiamenti molecolari tra cui l'induzione della proteina di legame dell'elemento di risposta del cAMP (CREB) e il ΔFosB, fattori di trascrizione che mostrano un up-regulation duraturo in risposta alla somministrazione cronica di cocaina [41], [42]. È importante sottolineare che Cdk5 è un obiettivo di ΔFosB [19], e molti componenti critici coinvolti nella dinamica della colonna vertebrale dendritica, come PSD-95, chinasi attivata da p21 (PAK), β-catenina e spinofillina, sono stati riportati come substrati Cdk5 [43]-[46]. Coerentemente, manipolazioni genetiche o farmacologiche dell'attività di Cdk5 provocano alterazioni della morfologia della colonna vertebrale dendritica e risposte comportamentali alla cocaina, implicando ruoli critici per Cdk5 nei cambiamenti molecolari e morfologici dei circuiti mesolimbici della dopamina [47], [48]. I nostri risultati che dimostrano che DRD2 è un nuovo obiettivo di Cdk5 fornisce ulteriori informazioni sui cambiamenti adattativi del sistema dopaminico in risposta a esposizioni croniche al farmaco a causa del conseguente up-regolazione ΔFosB-mediata di Cdk5 può indurre un aumento tonale nella fosforilazione di DRD2 . Inoltre, DRD2 è noto per influenzare numerosi processi cellulari, tra cui la regolazione delle vie cAMP e della chinasi MAP e degli eventi trascrizionali a valle [42], [49]. Pertanto, i risultati di questo studio potrebbero non solo illustrare una regolazione diretta di DRD2 da parte di Cdk5, ma anche fornire una nuova visione delle risposte adattive del sistema dopaminico all'esposizione cronica al farmaco.

Contributi degli autori

Concepito e progettato gli esperimenti: JJ YUP DH SKP. Eseguiti gli esperimenti: JJ YUP DKK YK. Analizzati i dati: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reagenti / materiali / strumenti di analisi forniti: YHS. Ha scritto il giornale: JJ SKP.