Fonte
Gruppo di Farmacologia Cellulare e Molecolare, Dipartimento di Farmacologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Murcia, Spagna.
Astratto
L'uso cronico di droghe d'abuso altera profondamente il sistema reattivo allo stress. L'esposizione ripetuta alla morfina porta all'accumulo del fattore di trascrizione ΔFosB, in particolare nelle aree cerebrali associate alla ricompensa e allo stress. Gli effetti persistenti di ΔFosB sui geni bersaglio potrebbero svolgere un ruolo importante nella plasticità indotta dalle droghe d'abuso. Prove recenti suggeriscono che gli ormoni correlati allo stress (ad esempio glucocorticoidi, GC) possono indurre adattamenti nel sistema cerebrale dello stress che probabilmente implicano alterazioni nell'espressione genica e nei fattori di trascrizione. Questo studio ha esaminato il ruolo del GC nella regolazione di FosB/ΔFosB nei sistemi cerebrali di stress sia ipotalamici che extraipotalamici durante la dipendenza da morfina. A tal fine, l'espressione di FosB/ΔFosB è stata misurata in ratti di controllo (sottoposti a intervento fittizio) e surrenectomizzati (ADX), resi dipendenti dagli oppiacei dopo dieci giorni di trattamento con morfina. Nei ratti sottoposti a intervento fittizio, FosB/ΔFosB è stato indotto dopo somministrazione cronica di morfina in tutte le aree cerebrali sottoposte a stress indagate: nucleo accumbens (NAc), nucleo del letto della stria terminale (BNST), amigdala centrale (CeA), nucleo paraventricolare ipotalamico (PVN) e nucleo del gruppo cellulare noradrenergico del tratto solitario (NTS-A(2)). L'adrenalectomia ha attenuato l'aumentata produzione di FosB/ΔFosB osservata dopo esposizione cronica a morfina in NAc, CeA e NTS. Inoltre, l'ADX ha ridotto l'espressione di FosB/ΔFosB nei neuroni CRH-positivi di BNST, PVN e CeA. Risultati simili sono stati ottenuti nei neuroni TH-positivi di NTS-A(2) e nei neuroni pro-dinorfina-positivi di NAc. Questi dati suggeriscono che il neuroadattamento (stimato come accumulo di FosB/ΔFosB) agli oppiacei nelle aree cerebrali associate allo stress è modulato dal GC, supportando l'evidenza di un collegamento tra gli ormoni dello stress cerebrale e la dipendenza.
Introduzione
Gli oppiacei, come la morfina, sono efficaci analgesici utilizzati per il trattamento di numerose forme di dolore acuto e cronico. Tuttavia, gravi effetti avversi, come tolleranza e astinenza, contribuiscono alla dipendenza da oppiacei e ne limitano l'uso. Inoltre, l'uso non terapeutico di oppiacei (eroina, morfina) è aumentato negli ultimi anni. Prove sempre più numerose implicano vari meccanismi di regolazione genica (inclusi effetti epigenetici, molecolari, cellulari e a livello di circuito) nei cambiamenti indotti nel cervello dalle droghe d'abuso, indicando una potenziale strategia terapeutica per la terapia delle dipendenze. [1]-[4].
Una questione centrale nel campo dell'abuso di droghe è stata l'identificazione delle proteine che mediano la transizione dagli effetti acuti a quelli a lungo termine di tali droghe. Di particolare interesse per lo studio della dipendenza è la famiglia di fattori di trascrizione Fos. Questa famiglia include c-Fos, Fra-1 e Fra-2, FosB e ΔFosB, una variante troncata di splicing di FosB a lunghezza intera. [5]A differenza di altri membri della famiglia Fos, ΔFosB viene indotta in modo modesto nel cervello dopo la somministrazione acuta del farmaco, ma a causa della sua insolitamente lunga emivita persiste per settimane, persino mesi, dopo la cessazione dell'uso del farmaco. Di conseguenza, I livelli di ΔFosB si accumulano gradualmente con l'esposizione ripetuta al farmaco [6], [7], suggerendo che ΔFosB potrebbe rappresentare un meccanismo attraverso il quale le droghe d'abuso producono cambiamenti duraturi nel modello di espressione genica molto tempo dopo che il farmaco è stato interrotto [8].
È stato riportato che l'esposizione ripetuta a cocaina, anfetamina, cannabinoidi o morfina porta a un aumento di ΔFosB nelle aree cerebrali correlate agli effetti di rinforzo positivo delle droghe, come il nucleo accumbens (NAc), la corteccia prefrontale e lo striato dorsale. Si è ipotizzato che questo aumento sia un neuroadattamento che porta a una maggiore sensibilità alle droghe d'abuso e alla vulnerabilità a sviluppare comportamenti tipici della dipendenza. [9]-[13]Abbiamo recentemente dimostrato cheL'aumento dei livelli di FosB/ΔFosB dopo la somministrazione cronica di morfina non è limitato solo al sistema di ricompensa, ma si verifica anche nel sistema dello stress cerebrale (che è stato collegato agli effetti di rinforzo negativi dei farmaci), così come nel nucleo del tratto solitario-A2 gruppo cellulare noradrenergico (NTS-A2, il principale sistema noradrenergico che innerva il neurocircuito dello stress) [14]In consonanza con questi risultati, diverse forme di stress cronico inducono anche ΔFosB nel NAc e in altre regioni del cervello [15], [16].
La dipendenza è un disturbo complesso perché molti fattori contribuiscono allo sviluppo e al mantenimento di questo disturbo neurologico. Uno di questi è lo stress, che è stato coinvolto in aspetti specifici della tossicodipendenza. [17]-[21]Sia l'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA, la principale via di stress endocrino) che il sistema di stress extraipotalamico (che comprende l'amigdala estesa e l'NTS-A)2) sono disregolati dalla somministrazione cronica di farmaci con potenziale di dipendenza [14], [22]. Inoltre, la risposta dell'asse HPA è simile sia dopo stimoli stressanti che dopo un'esposizione acuta a droghe d'abuso. [23], [24], con elevato rilascio di ormone di rilascio della corticotropina (CRH), ormone adrenocorticotropo (ACTH) e glucocorticoidi (GC). Tquesta risposta facilita l'adattamento ai cambiamenti ambientali acuti, ma può anche portare a patologie comportamentali durante condizioni di stress cronico, come dipendenza e depressione [25]Non sono ancora stati condotti studi approfonditi sulla relazione tra GC e induzione di FosB/ΔFosB indotta dalla dipendenza da morfina nel sistema cerebrale dello stress. Abbiamo quindi valutato l'influenza di GC sull'espressione di FosB/ΔFosB dopo somministrazione continua di morfina nelle aree cerebrali correlate allo stress. Per rispondere a questa domanda, abbiamo innanzitutto esaminato gli effetti della surrenectomia bilaterale (ADX) sull'immunoreattività (IR) di FosB/ΔFosB nei nuclei principali del sistema dello stress in ratti dipendenti da morfina.
L'attività del sistema cerebrale dello stress è mediata da numerosi neurotrasmettitori/neuromodulatori. Il CRH è il principale neuropeptide che regola l'attività del sistema dello stress ed è stato postulato il suo contributo sia nella vulnerabilità preesistente all'uso di droghe in modo assuefacente che nella successiva vulnerabilità alla ricaduta. [26]. IoInoltre, numerosi lavori supportano l'importanza dell'NTS-A2 innervazione del sistema cerebrale dello stress nella tossicodipendenza e il ruolo fondamentale della noradrenalina (NA) come neurotrasmettitore che modula questo neurocircuito [27]Infine, prove sostanziali suggeriscono che l'espressione della dinorfina viene attivata nello striato e nell'amigdala durante la somministrazione acuta e cronica del farmaco. [28]Alla luce di questi fatti, l'obiettivo successivo di questo studio è stato quello di identificare il ruolo del GC sull'espressione di FosB/ΔFosB in popolazioni specifiche del sistema dello stress cerebrale durante la dipendenza da morfina.
Risultati
Effetti dell'adrenalectomia sull'aumento di peso corporeo e sulla concentrazione plasmatica di ACTH e corticosterone nei ratti dipendenti dalla morfina
Prima di eseguire i test di immunodetezione, abbiamo valutato l'efficacia del trattamento cronico con morfina. A tal fine, il peso degli animali è stato registrato il giorno dell'impianto dei pellet e il giorno della soppressione (giorno 10). L'ANOVA a due vie ha rivelato significativi effetti principali sull'aumento di peso corporeo in seguito a surrenectomia [F(1,47)
=13.24, p=0.0007), trattamento con morfina [F(1,47)=281.05, p<0.0001] e un'interazione tra ADX e trattamento con morfina [F(1,47)=4.13, p=0.0479]. In accordo con i risultati precedenti [29], [30], post hoc l'analisi ha indicato che sia i gruppi fittizi che quelli ADX resi dipendenti dalla morfina hanno mostrato un significativo (p<0.001) aumento di peso inferiore (−13.75±5.0 g, n=12; 3.84±2.45 g, n=13, rispettivamente) rispetto a quello osservato negli animali sham e ADX che ricevevano pellet placebo (44.58±1.7 g, n=12; 49.57±2.4 g, n=12, rispettivamente), che è stato attribuito alla ridotta assunzione di cibo osservata in questi animali [29].
Per verificare l'efficacia della surrenectomia, sono state misurate le concentrazioni ormonali plasmatiche. Un'analisi della varianza a due vie che esaminava gli effetti della surrenectomia e della morfina sulle concentrazioni plasmatiche di ACTH e corticosterone ha mostrato effetti principali significativi della surrenectomia [ACTH: F(1,18)]=68.12, p<0.0001; corticosterone: F(1,45)=10.42, p=0.0023). Come previsto, Newman post hoc il test ha mostrato (Fig. S1) che nel placebo (n=6)- e morfina (n=4)-La concentrazione plasmatica di ACTH nei ratti ADX era più elevata (p<0.001) rispetto agli animali sottoposti a intervento fittizio per i due trattamenti valutati (placebo, n=6; e morfina, n=6). Non sono state osservate modifiche nella concentrazione plasmatica di corticosterone tra ADX-placebo (n=14) e ADX-morfina (n=13) ratti trattati. La concentrazione di corticosterone nei ratti trattati con ADX-morfina era significativamente (p<0.01) inferiori a quelli osservati nella morfina fittizia (n=10) ratti trattati. Non sono stati osservati cambiamenti significativi nel gruppo trattato con morfina fittizia rispetto al gruppo trattato con placebo fittizio (n=12).
L'adrenalectomia attenua in modo differenziale il FosB/ΔFosB indotto dalla dipendenza da morfina nelle sottoregioni del sistema di stress cerebrale
Negli animali di controllo (ratti trattati con placebo), è stata identificata una debole espressione costitutiva di FosB/ΔFosB-IR in tutte le aree del sistema cerebrale correlato allo stress. Il trattamento cronico con morfina ha determinato la comparsa di FosB/ΔFosB in tutte le aree cerebrali studiate. Nel NAc(shell), l'ANOVA a due vie ha mostrato significativi effetti principali della surrenectomia [F(1,16)=6.44, p=0.0220] e trattamenti cronici con morfina [F(1,16)=19.98, p=0.0004]. Il test post hoc di Newman-Keuls ha mostrato (Figura 2A–E) che nei ratti trattati con morfina si è registrato un aumento significativo (p<0.01) dell'espressione di FosB/ΔFosB. Nei ratti ADX dipendenti da morfina, si è osservata una riduzione significativa (p<0.05) dell'espressione proteica di FosB/ΔFosB nel NAc. L'ANOVA a due vie per BNST ha mostrato un effetto principale significativo del trattamento cronico con morfina [F(1,16)=48.92, p<0.0001]. L'analisi post hoc ha rivelato un aumento (p<0.001) in FosB/ΔFosB sia negli animali dipendenti da morfina fittizia che da morfina ADX, indicando che la regolazione di FosB/ΔFosB era correlata all'esposizione cronica alla morfina indipendentemente dalla concentrazione di GC (Figura 2F–J). L'ANOVA bidirezionale per FosB/ΔFosB nel CeA ha mostrato effetti significativi della surrenectomia [F(1,15)=20.51, p=0.0004] e pretrattamento con morfina [F(1,15)=27.52, p<0.0001]. Post hoc Il test ha mostrato un aumento significativo (p<0.01) nei livelli di FosB/ΔFosB nei ratti trattati con morfina fittizia rispetto ai ratti trattati con placebo fittizio, che è stato attenuato (p<0.01) nel gruppo dipendente dalla morfina ADX (Figura 2K–O). Inoltre, i ratti trattati con placebo ADX hanno mostrato livelli inferiori (p<0.01) di FosB/ΔFosB rispetto al gruppo placebo fittizio.
L'ANOVA bidirezionale che esamina gli effetti della surrenectomia e della morfina sull'espressione di FosB/ΔFosB nel PVN (suddivisione parvocellulare) ha rivelato un effetto significativo del trattamento con morfina [F(1,16)=16.31, p<0.0001]. Post hoc l'analisi ha mostrato una significativa (Figura 3A–E) aumento (p<0.05) di FosB/ΔFosB-IR nel PVN di ratti trattati con morfina fittizia e ADX. Nel NTS-A2 gruppo cellulare catecolaminergico, l'ANOVA bidirezionale ha rivelato un effetto principale del trattamento con morfina [F(1,11)=76.33, p<0.0001]. Post hoc l'analisi ha mostrato una significativa (Figura 3F–J) aumento di FosB/ΔFosB-IR nei ratti trattati con morfina fittizia rispetto al gruppo trattato con placebo fittizio (p<0.001), che è stato attenuato (p<0.05) nel gruppo dipendente dalla morfina ADX.
L'esposizione cronica alla morfina induce l'espressione di FosB/ΔFosB nei neuroni CRH in PVN, BNST e CeA. Influenza dei glucocorticoidi
L'ANOVA bidirezionale per i neuroni FosB/ΔFosB-positivi/CRH-positivi nel BNST ha mostrato l'effetto principale della surrenectomia [F(1,20)=64.43, p<0.0001] e significativa interazione tra surrenectomia e trattamento con morfina [F(1,20)=6.80, p=0.0169]. Nel PVN, l'ANOVA bidirezionale ha rivelato un effetto principale significativo della surrenectomia [F(1,19)=11.35, p=0.0032]. L'ANOVA bidirezionale per i neuroni FosB/ΔFosB-positivi/CRH-positivi nel CeA ha mostrato un effetto principale significativo della surrenectomia [F(1,20)=106.85, p<0.0001], trattamento con morfina [F(1,20)=7.33, p=0.0136] e significativa interazione tra surrenectomia e pretrattamento farmacologico [F(1,20)=7.07, p=0.0151]. Figure 4, , 5,5, ,66 mostrano immagini rappresentative di sezioni BNST, PVN e CeA di ratti sottoposti a controllo fittizio o ADX e ratti dipendenti dalla morfina. Post hoc L'analisi ha rivelato che un numero significativo di neuroni FosB/ΔFosB-positivi sono stati trovati a co-esprimere CRH nel BNST (p<0.01; Fig. 4E), PVN (p<0.05; Fig. 6E) e CeA (p<0.01; Fig. 6E) nei ratti trattati con morfina simulata rispetto al gruppo placebo simulato. Inoltre, il numero di neuroni FosB/ΔFosB-positivi che co-esprimono CRH nei ratti trattati con placebo ADX e nei ratti dipendenti dalla morfina era significativamente inferiore nei tre nuclei rispetto al trattamento corrispondente negli animali simulati, come mostrato in Figure 4, , 5,5, ,66 (BNST: p<0.01 vs. placebo più placebo; p<0.001 vs. placebo più morfina; PVN: p<0.05 vs. placebo più placebo; p<0.001 vs. placebo più morfina; CeA: p<0.001 rispetto a placebo e rispetto a morfina e placebo).
A livello BNST, l'ANOVA bidirezionale per il numero di neuroni CRH-positivi ha mostrato che c'era un effetto principale dell'ADX [F(1,20)=103.92, p<0.0001] così come la morfina cronica [F(1,20)=4.35, p<0.05]. Come mostrato in Tabella 1, Newman–Keuls post hoc Il test ha rivelato che i ratti trattati con ADX placebo e morfina mostravano una minore concentrazione di neuroni CRH (p<0.001) rispetto ai gruppi placebo fittizio o morfina-dipendenti. Al PVN, l'ANOVA a due vie ha mostrato un effetto significativo della surrenectomia [F(1,19)=11.35, p=0.0032]. L'ANOVA bidirezionale per i neuroni CRH totali a livello di CeA ha rivelato effetti significativi dell'ADX [F(1,20)=240.09, p<0.0001] e interazione principale tra ADX e morfina cronica [F(1,20)=4.49, p=0.0467]. Tabella 1 descrive che si è verificata una diminuzione significativa dei neuroni CRH a livello del CeA nei ratti trattati con placebo ADX o con morfina. Tabella 1 dimostra inoltre che l'esposizione cronica alla morfina induce un aumento (p<0.05) dei neuroni CRH-positivi ai livelli di BNST e CeA.
Effetti dell'adrenalectomia su FosB/ΔFosB nei neuroni DYN-positivi nel NAc(Shell)
Non abbiamo osservato cambiamenti significativi nel numero di cellule pro-DYN-positive che co-esprimono FosB/ΔFosB nel NAc(shell) dopo l'esposizione cronica alla morfina (Fig. 7) rispetto al gruppo placebo. L'ANOVA a due vie per i neuroni FosB/ΔFosB-positivi/pro-DYN-positivi nel NAc(shell) ha mostrato l'effetto principale dell'ADX [F(1,19)=10.11, p=0.0049]. Come mostrato in Fig. 7C, il numero di neuroni FosB/ΔFosB-positivi che co-esprimono pro-DYN nei ratti dipendenti dalla morfina ADX era significativamente (p<0.05) inferiore rispetto al trattamento corrispondente negli animali simulati. Come mostrato in Tabella 1, ADX non ha indotto alcun cambiamento nella cellula pro-DYN totale dal NAc(shell).
L'adrenalectomia inibisce la produzione di FosB/ΔFosB indotta dalla dipendenza da morfina nei neuroni TH-positivi nel NTS-A2 Gruppo cellulare noradrenergico
ANOVA bidirezionale per neuroni FosB/ΔFosB-positivi/TH-positivi nel NTS-A2 ha mostrato l'effetto principale dell'ADX [F(1,15)=64.86, p<0.0001], trattamento con morfina [F(1,15)=29.62, p<0.0001], e significativa interazione tra surrenectomia e trattamento con morfina [F(1,15)=19.24, p=0.0005]. Newman-Keuls post hoc Il test indica che un numero significativo di neuroni FosB/ΔFosB-positivi sono stati trovati a co-esprimere TH nel NTS (p<0.001; Fig. 7F) nei ratti trattati con morfina fittizia. Inoltre, il numero di neuroni FosB/ΔFosB-positivi che co-esprimono TH nei ratti ADX dipendenti dalla morfina era significativamente inferiore (p<0.001) rispetto al trattamento corrispondente negli animali fittizi, come mostrato in Fig. 7FD'altra parte, come mostrato in Tabella 1, l'ADX non ha indotto cambiamenti nel totale dei neuroni TH-positivi nel NTS.
Discussione
I risultati attuali hanno indicato, per la prima volta, che la segnalazione GC cerebrale ha modulato l'espressione FosB/ΔFosB indotta dalla somministrazione cronica di morfina nel sistema di stress cerebrale in modo specifico per regione.
Linee di evidenza convergenti indicano che lo stress aumenta il rischio di comportamenti di dipendenza [18]Stimoli stressanti persistenti alterano la sintesi, l'espressione e la segnalazione nelle vie di segnalazione correlate allo stress (ad esempio CRH, GC, NA, ecc.). Inoltre, le droghe d'abuso influenzano le vie di segnalazione dello stress, il che si traduce in un'alterazione dell'espressione genica, con effetti sulla segnalazione delle molecole correlate alla ricompensa e allo stress. [31]Lo stress e l'abuso di droghe hanno in comune la capacità di innescare modelli sovrapposti di attivazione neuronale nel sistema nervoso centrale, con conseguente attivazione immediata dell'espressione genica.
È stato ampiamente descritto che le sostanze che creano dipendenza e gli stimoli stressanti cronici aumentano l'espressione del fattore di trascrizione ΔFosB nei nuclei principali coinvolti nei loro effetti di rinforzo positivi [12], [13], [32], [33], ed è stato proposto che gli effetti persistenti di ΔFosB sui geni bersaglio potrebbero svolgere un ruolo importante nello sviluppo degli adattamenti che caratterizzano la dipendenza [9], [34]Tuttavia, si sa ancora poco sull'espressione di ΔFosB nel sistema cerebrale dello stress dopo la somministrazione cronica di droghe d'abuso o sui meccanismi molecolari dell'accumulo di ΔFosB indotto dalla morfina nelle aree correlate allo stress.
Nel presente studio, abbiamo indagato il coinvolgimento del GC nell'espressione FosB/ΔFosB indotta dalla morfina nel sistema di stress ormonale (asse HPA), che è controllato dal CRH nel PVN, così come nei sistemi di stress extraipotalamici (che includono l'amigdala estesa; [35]), mediato dal CRH e da altri sistemi correlati allo stress (inclusi NA e dinorfina; [19]).
Abbiamo recentemente dimostrato che la somministrazione cronica di morfina per sette giorni ha aumentato l'espressione di FosB/ΔFosB nell'amigdala estesa, nel PVN e nel NTS-A2 [14]In linea con questi dati, i risultati attuali mostrano che la somministrazione cronica di morfina ha provocato un aumento di FosB/ΔFosB in CeA, BNST e NAc(shell) così come nel PVN e NTS-A2L'amigdala estesa è stata associata alla gratificazione da droghe. Infatti, tutte le principali droghe d'abuso attivano la trasmissione dopaminergica dalla VTA al NAc (guscio) e alla CeA. È stato dimostrato che questa attivazione e i conseguenti effetti di rinforzo positivo delle sostanze d'abuso sono correlati alle azioni del GC sul GR situato nella VTA [28]A supporto di questa ipotesi, i nostri risultati mostrano che FosB/ΔFosB-IR nel NAc(shell) e nel CeA è stato attenuato negli animali ADX, il che potrebbe indicare un'interazione tra i fattori di trascrizione AP-1 e GR durante la dipendenza dalla morfina. [36]Contrariamente agli effetti osservati dell'ADX sull'espressione di FosB in NAc e CeA, i risultati attuali suggeriscono che la morfina cronica ha aumentato l'espressione di Fos/ΔFosB nel PVN e nel BNST in modo indipendente dal GC.
Diversi neurotrasmettitori del sistema di stress cerebrale, come CRH, NA e DYN, sono stati correlati con gli stati avversivi caratteristici del processo di dipendenza [35], [37]-[39]I risultati attuali hanno mostrato che l'esposizione cronica alla morfina ha provocato un aumento significativo dell'espressione di Fos/ΔFosB nei neuroni contenenti CRH nel BNST, CeA e PVN. La famiglia di fattori di trascrizione Fos può agire sui siti degli elementi di risposta all'AMP ciclico (CRE). [40]. Numerose prove indicano che ΔFosB può agire come repressore o attivatore trascrizionale [40], [41]. solPoiché il gene CRH ha un motivo CRE nella sua sequenza promotore, si potrebbe proporre che l'accumulo di FosB/ΔFosB nei neuroni CRH possa mediare i cambiamenti indotti dalla morfina nei livelli di CRH, come riportato per gli effetti della cocaina [42], in particolare nella CeA e nel BNST, dove, per la prima volta, abbiamo segnalato un aumento del numero di neuroni CRH-positivi durante la dipendenza da morfina. A supporto di questa ipotesi, è stato descritto un aumento dei livelli di mRNA di CRH nella CeA dopo somministrazione cronica di morfina. [43]Tuttavia, il numero di neuroni CRH-positivi è rimasto invariato nel PVN dopo il trattamento cronico con morfina. Questi risultati sono in accordo con precedenti osservazioni che dimostrano che l'esposizione cronica alla morfina non induce alterazioni nell'hnRNA del CRH nel PVN. [44]Poiché l'espressione CRH del PVN è sottoregolata dal GC [45], e dato che il lavoro attuale e gli altri [29], [44] hanno dimostrato che l'esposizione cronica agli oppiacei non modifica il rilascio di corticosterone, sembra logico che la somministrazione cronica di morfina non modifichi il numero di cellule CRH.
La somministrazione periferica di corticosterone aumenta l'espressione dell'mRNA di CRH nel CeA e nel BNST [46], [47]Inoltre, l'ADX ha ridotto l'espressione di CRH nel CeA [48], [49]Di conseguenza, abbiamo osservato che l'aumento del numero di neuroni CRH nel BNST e nella CeA durante la dipendenza da morfina è stato abolito dopo la surrenectomia. Dato che l'aumento di Fos/ΔFosB all'interno dei neuroni CRH durante la dipendenza da morfina è stato attenuato negli animali ADX, si potrebbe ipotizzare un ruolo di Fos/ΔFosB nella regolazione dell'espressione di CRH da parte dei GC nell'amigdala estesa. D'altra parte, è noto che i GC regolano negativamente l'espressione del gene CRH nel PVN. [45]In accordo, i dati attuali hanno chiaramente mostrato che la surrenectomia ha abolito l'aumento di Fos/ΔFosB-IR nei neuroni contenenti CRH durante la dipendenza da morfina in questo nucleo.
In questo studio, i dati immunochimici hanno rivelato che il trattamento cronico con morfina ha aumentato significativamente la colorazione per Fos/ΔFosB nel NTS-A2, che è diminuito in seguito a ADX. Quando abbiamo esaminato le specifiche popolazioni neurali che esprimevano FosB/ΔFosB, abbiamo riscontrato un robusto aumento di Fos/ΔFosB-IR nei neuroni positivi per TH (l'enzima limitante la velocità di sintesi delle catecolamine). È stato dimostrato che la NA svolge un ruolo fondamentale nella dipendenza. [50]In studi precedenti, l'esposizione cronica alla morfina ha provocato un aumento dei livelli di TH nel NTS-A2 [14], [29]È noto che il gene TH ha un sito AP-1 nel suo promotore [51]I nostri risultati potrebbero suggerire che FosB/ΔFosB è coinvolto nell'aumento dei livelli di TH indotto dagli oppioidi nel NTS-A2Il gruppo di cellule noradrenergiche del tronco encefalico esprime alti livelli di recettori GC (GR). È stato dimostrato che i GC hanno un ruolo permissivo nella neurotrasmissione noradrenergica. [29], [30], [52]Di conseguenza, la somministrazione di antagonisti dei GR ha influenzato diversi aspetti dell'attività NA, tra cui l'attivazione dei TH e l'attività neuronale [30]I risultati attuali hanno mostrato che, a seguito di ADX, si è verificata una diminuzione delle cellule TH-positive che esprimono FosB/ΔFosB nel NTS-A2Considerato che la surrenectomia ha bloccato l'aumento dei livelli di proteine TH nel NTS-A2 durante la dipendenza da morfina [29], e che un sito GRE/AP-1 è stato descritto nel promotore del gene TH [53], i nostri dati potrebbero indicare ΔFosB come mediatore negli effetti del GC sull'attività noradrenergica nel NTS-A2 durante la dipendenza da oppiacei.
DYN è stato postulato come possibile gene bersaglio di ΔFosB [54], [55]I nostri risultati mostrano che l'esposizione cronica alla morfina non ha alterato significativamente l'espressione di FosB/ΔFosB nei neuroni che esprimono pro-DYN nel NAc(shell). Per quanto riguarda la regolazione ΔFosB dell'espressione DYN, Zachariou et al [33] hanno riportato una piccola ma significativa diminuzione dei livelli di mRNA di DYN nel NAc di topi con sovraespressione di ΔFosB, ipotizzando quindi che questo fattore di trascrizione inibisca l'espressione di DYN. Dai nostri dati, non si può concludere che la morfina cronica modifichi l'espressione di DYN attraverso l'attività di FosB/ΔFosB, dato che i nostri risultati sono stati ottenuti a livello proteico.
È stato postulato che il sistema oppioide DYN/kappa sembra indurre stati pro-depressivi che comportano elementi di avversione. Questa risposta avversiva può comportare interazioni reciproche con NAc, DA e il sistema CRH extraipotalamico [35]Tuttavia, si sa ancora poco sulla possibile regolazione da parte dei GC dell'espressione di DYN nel NAc. È stato proposto che ΔFosB nel NAc, in parte attraverso la repressione dell'espressione DYN, aumenti la sensibilità agli effetti gratificanti della morfina e della cocaina e porti alla resilienza allo stress [9], [33]I nostri dati supportano il ruolo dei GC nella regolazione degli effetti di rinforzo positivo della morfina mediati dal sistema dopaminergico mesocorticolimbico, dato che il numero di neuroni FosB/ΔFosB/pro-DYN-positivi diminuisce nel NAc dei ratti ADX. Questi effetti potrebbero essere mediati direttamente dai GR, presenti lungo tutta la via di ricompensa mesolimbica, o indirettamente tramite proiezioni di CRH che derivano da CeA e/o dal BNST verso la VTA e il NAc, che risultano sottoattivate durante la dipendenza da morfina nei ratti ADX.
In sintesi, questo studio dimostra che i GC sono coinvolti in modo critico nell'accumulo di FosB/ΔFosB nei sistemi cerebrali di stress dopo esposizione cronica a morfina, il che potrebbe determinare alterazioni durature del pattern di espressione genica nelle aree correlate allo stress. I risultati attuali indicano inoltre che FosB/ΔFosB potrebbe contribuire alle alterazioni GC-dipendenti sulla plasticità del sistema cerebrale di stress durante la dipendenza da oppiacei. Sono necessari ulteriori studi per determinare i meccanismi intracellulari attraverso i quali gli oppiacei cronici inducono FosB/ΔFosB in regioni selezionate correlate allo stress, nonché il meccanismo responsabile della soppressione dell'espressione di FosB/ΔFosB indotta dalla morfina da parte dei GC.
Metodi
Materiali Necessari
Corticosterone e colesterolo sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Pellet di corticosterone sono stati prodotti dal Dott. Márton Vajna (Dipartimento di Amministrazione Farmaceutica, Università di Farmacia, Università Semmelweis, Budapest, Ungheria). Pellet di morfina base (Alcaliber Laboratories, Madrid, Spagna) o lattosio (controllo) sono stati preparati presso il Dipartimento di Farmacia e Tecnologia Farmaceutica (Facoltà di Farmacia, Granada, Spagna). Il pentobarbital è stato acquistato da Hospira (Hoofddorp, Paesi Bassi). Ketamina cloridrato e xilazina sono state acquistate rispettivamente da Labs. Merial (Lione, Francia) e Labs. Calier (Barcellona, Spagna).
Animali
Ratti Sprague-Dawley maschi (220–240 g all'inizio dell'esperimento; Harlan, Barcellona, Spagna) sono stati alloggiati in coppie in gabbie (lunghezza 45 cm; larghezza 24 cm; altezza 20 cm) all'arrivo in una stanza con temperatura (22±2°C) e umidità (50±10%) controllate, con libero accesso ad acqua e cibo (Harlan Teklad standard rodent chow; Harlan Interfauna Ibérica, Barcellona, Spagna). Gli animali sono stati adattati a un ciclo luce-buio standard di 12 ore (luce accesa: 08:00 – 20:00) per 7 giorni prima dell'inizio degli esperimenti. Tutte le procedure chirurgiche e sperimentali sono state eseguite in conformità con la Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) e sono state approvate dai Comitati locali per la ricerca sugli animali (REGA ES300305440012). Lo studio è stato approvato dal comitato di bioetica dell'Università di Murcia (RD 1201/2005) e dal Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF/FEDER 2009-07178), Spagna.
surrenalectomia
I ratti sono stati sottoposti a surrenectomia bilaterale e un pellet di corticosterone è stato impiantato per garantire livelli bassi ma stabili di GC [29]I ratti sono stati sottoposti a surrenectomia bilaterale (ADX) tramite approccio dorsale in anestesia con 90 mg/kg di ketamina cloridrato e 8 mg/kg di xilazina (ip) e sottoposti a impianto sottocutaneo (sc) di pellet di corticosterone a lento rilascio durante l'intervento chirurgico. La composizione dei pellet di steroidi (25 mg di corticosterone più 75 mg di colesterolo) è stata scelta per fornire una concentrazione stabile di corticosterone corrispondente al nadir circadiano fino a 20 giorni dopo l'impianto. [56]I ratti ADX sottoposti a terapia sostitutiva con corticosterone (ADX più corticosterone) non presentano un aumento del corticosterone plasmatico indotto dalla sfida. [56]Dopo l'intervento chirurgico, i ratti trattati con ADX più corticosterone avevano la possibilità di scegliere liberamente di assumere soluzione salina isotonica (0.9% NaCl) per reintegrare il sodio impoverito a causa della perdita di aldosterone dovuta alla surrenectomia. I ratti di controllo sono stati sottoposti alla stessa procedura chirurgica (sham) senza asportazione surrenalica. Ai ratti sham e ADX più corticosterone è stato permesso di riprendersi dall'intervento chirurgico per 5 giorni prima della procedura di dipendenza da morfina. Il successo della surrenectomia bilaterale è stato confermato dalla concentrazione plasmatica di corticosterone e ACTH e dall'esame autoptico degli animali trattati con ADX.
Trattamento farmacologico e procedura sperimentale
Cinque giorni dopo l'intervento chirurgico, ai ratti sono stati impiantati per via sottocutanea due pellet di morfina da 75 mg in anestesia leggera con etere. I ratti di controllo hanno ricevuto pellet di placebo contenenti lattosio. Questa procedura ha dimostrato di produrre concentrazioni plasmatiche di morfina costanti a partire da poche ore dopo l'impianto dei pellet e una sindrome da astinenza completa dopo l'iniezione acuta di antagonisti degli oppioidi. [57]La dipendenza dalla morfina viene raggiunta 24 ore dopo l'impianto dei pellet e rimane costante per 15 giorni. [58]Dieci giorni dopo l'impianto di pellet di morfina o placebo, i ratti sono stati sacrificati. Le quattro condizioni sperimentali studiate per l'attività dell'asse HPA (concentrazione plasmatica di corticosterone e ACTH), l'espressione di FosB/ΔFosB, l'espressione di CRH, l'espressione di DYN, l'espressione di TH e l'espressione di FosB/ΔFosB nei neuroni CRH, DYN e TH positivi erano: (i) placebo simulato; (ii) morfina simulata; (iii) ADX-placebo; (iv) ADX-morfina. L'aumento di peso dei ratti è stato controllato durante il trattamento per garantire che la morfina fosse liberata correttamente dai pellet, poiché è noto che il trattamento a lungo termine con morfina induce una riduzione dell'aumento di peso corporeo dovuta a un minore apporto calorico. [29].
Perfusione e sezionamento del cervello
I ratti sono stati anestetizzati profondamente con una dose eccessiva di pentobarbital (100 mg/kg ip) e perfusi per via transcardiaca con soluzione salina, seguita da fissativo contenente paraformaldeide (paraformaldeide al 4% in tampone borato 0.1 M, pH 9.5). Dopo la rimozione dei cervelli perfusi, sono stati fissati nello stesso fissativo per 3 ore e conservati a 4°C in PBS contenente il 10% di saccarosio fino al taglio rostro-caudale di sezioni coronali (spessore 30 µm) su un microtomo congelatore (Leica, Nussloch, Germania). L'atlante di Paxinos e Watson (2007) [59] è stato utilizzato per identificare diverse regioni cerebrali dei ratti: NAc(shell), BNST, PVN, CeA e NTS-A2 (Figure 1 ). Le sezioni sono state crioprotette e conservate a -20°C fino al momento dell'utilizzo.
Immunoistochimica FosB/ΔFosB
Le sezioni sono state elaborate per l'immunoistochimica come descritto da Núñez et al [29]In breve, dopo il blocco con H allo 0.3%2O2 e sezioni di tessuto di siero di capra normale al 2% (Sigma, USA) sono state incubate in antisiero primario anti-FosB/ΔFosB (policlonale di coniglio, #sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1![[rapporto]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1000). L'anticorpo primario utilizzato in questo studio non discrimina tra FosB e la sua variante di splicing stabile ΔFosB. È stato dimostrato che l'esposizione ripetuta a stimoli che inducono FosB desensibilizza l'inducibilità acuta di FosB. [15], [40], [60]. Pertanto, le differenze tra la colorazione FosB/ΔFosB nei ratti pretrattati con morfina e non pretrattati possono essere interpretate come il riflesso principale di differenze nell'accumulo di ΔFosB. Gli antigeni sono stati visualizzati con il protocollo convenzionale avidina-biotina-immunoperossidasi (Vectastain ABC Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). La reazione con 3,3'-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB; Sigma, USA) è stata intensificata con solfato di nichel-ammonio. Le sezioni sono state montate su vetrini rivestiti con gelatina di allume di cromo, disidratate e coperte con coprioggetto.
Immunoistochimica a doppia marcatura di nuclei immunoreattivi FosB/ΔFosB e neuroni CRH-, TH- e DYN-positivi
Per la doppia marcatura FosB/ΔFosB-TH, le sezioni di tessuto di ciascun ratto in ciascun gruppo di trattamento sono state processate per l'immunoreattività FosB/ΔFosB mediante intensificazione del nichel con DAB e successivamente il TH è stato rivelato utilizzando solo il cromogeno DAB. L'immunocolorazione FosB/ΔFosB è stata eseguita come descritto in precedenza. Dopo la colorazione FosB/ΔFosB, le sezioni sono state lavate in PBS, trattate con siero di capra normale al 2% e quindi incubate per una notte con l'anticorpo policlonale di coniglio anti-TH (AB152, Chemicon, USA; 16000) a temperatura ambiente. Sono state seguite le stesse procedure di immunoistochimica descritte sopra. Il complesso anticorpo TH-perossidasi è stato sviluppato in DAB. Le sezioni sono state montate su vetrini rivestiti di gelatina di cromo-allume e coperte con coprioggetto.
Per la doppia marcatura con FosB/ΔFosB-CRH e FosB/ΔFosB-pro-DYN, il processo è stato lo stesso descritto in precedenza per FosB/ΔFosB-TH. Per rilevare i neuroni esprimenti DYN nel NAc, è stata applicata una procedura di recupero dell'antigene incubando le sezioni cerebrali in tampone citrato (10 mM di acido citrico, 0.05% di Tween 20, pH 6.0) a 60 °C per 20 minuti prima della procedura di blocco. L'antisiero primario di coniglio anti-CRH è stato gentilmente fornito da Wylie W. Vale (The Salk Institute, La Jolla, CA, USA) ed è stato utilizzato a 1Diluizione 500 per 72 ore a 4°C. L'anticorpo primario pro-DYN è stato acquistato da Neuromics (# GP10110, Neuromics, Edina, MN, USA) e diluito 12000 (72 ore, 4°C).
Analisi delle immagini
Le immagini sono state acquisite tramite un microscopio Leica (DM 4000B; Leica) collegato a una videocamera (DFC290, Leica). I nuclei cellulari FosB/ΔFosB-positivi sono stati contati utilizzando un sistema di analisi delle immagini assistito da computer (QWIN, Leica). I confini dell'NTS-A2, BNST, CeA, NAc(shell) e la suddivisione parvocellulare del PVN sono stati delineati e il numero di profili positivi è stato registrato. Il numero di profili nucleari FosB/ΔFosB all'interno dei confini dei gruppi cellulari di interesse è stato contato bilateralmente in quattro o cinque sezioni di ciascun ratto e mediato per ottenere un singolo valore per ciascun ratto. Per evitare bias di osservazione, tutte le sezioni sono state quantificate da un ricercatore in cieco. I conteggi totali per le diverse regioni cerebrali sono espressi come media ± errore standard (SEM).
Quantificazione delle cellule TH, CRH e DYN positive e profili di doppia colorazione FosB/ΔFosB
I nuclei positivi per l'immunoreattività FosB/ΔFosB sono stati rilevati utilizzando la stessa microscopia ottica convenzionale descritta sopra e contati a 40 ingrandimenti. Le cellule CRH, TH o DYN FosB/ΔFosB-positive sono state identificate come cellule con depositi citosolici marroni per la colorazione CRH-positiva, TH-positiva e DYN-positiva e colorazione nucleare blu/scura per FosB/ΔFosB. Un campo quadrato (195 µm) è stato sovrapposto all'immagine acquisita da utilizzare come area di riferimento. Il numero di neuroni doppiamente marcati osservati bilateralmente è stato contato in quattro o cinque sezioni di ciascun animale nel PVN, BNST e CeA per i neuroni CRH, NTS per i neuroni TH e NAc per i neuroni DYN. Sono state incluse nell'analisi anche le cellule CRH, TH e DYN positive senza nucleo visibile (cellule CRH, TH o DYN FosB/ΔFosB-negative).
radioimmunologico
Il sangue è stato raccolto in provette raffreddate con ghiaccio contenenti EDTA al 5% ed è stato quindi centrifugato (500 g; 4°C; 15 min). Il plasma è stato separato, diviso in due aliquote e conservato a -80°C fino al dosaggio del corticosterone o dell'ACTH. La concentrazione plasmatica di corticosterone e ACTH è stata quantificata utilizzando anticorpi specifici per corticosterone e ACTH nei ratti ([125I]-CORT e [125I]-ACTH RIA; MP Biomedicals, Orangeburg, NY, USA). La sensibilità del test è stata di 7.7 ng/mL per il corticosterone e di 5.7 pg/mL per l'ACTH.
Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± errore standard (SEM) e sono stati analizzati utilizzando il pacchetto statistico GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). I dati sono stati analizzati mediante analisi della varianza a due vie (ANOVA) con trattamento (placebo, morfina) e intervento chirurgico (sham, ADX) come variabili indipendenti. È stata utilizzata la scala Newman-Keuls. post hoc Il test è stato utilizzato per i confronti tra i singoli gruppi. Le differenze con ap < 0.05 sono state considerate significative.
informazioni di supporto
Figura S1
Effetti della surrenectomia (ADX) sulle concentrazioni plasmatiche di ACTH (A) e corticosterone (B) nei controlli e negli animali trattati con morfina. L'ADX chirurgico ha aumentato i livelli di ACTH sia nei ratti trattati con placebo che in quelli trattati con morfina, mentre ha ridotto la concentrazione plasmatica di corticosterone nei ratti trattati con morfina. I dati rappresentano la media ± SEM dei livelli plasmatici di ACTH e corticosterone in ratti pretrattati con placebo o morfina per 10 giorni. ***p<0.001 rispetto al placebo fittizio; ++p<0.01 +++p<0.001 rispetto alla morfina fittizia.
(TIF)
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Márton Vajna e Anna Földes, dell'Università Semmelweis (Budapest, Ungheria) per la preparazione dei pellet di corticosterone.