J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
Fonte
Dipartimento di Psichiatria, Centro di Neuroscienze di base, Università del Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.
Astratto
Il fattore di trascrizione DeltaFosB (noto anche come FosB2 o FosB [forma breve]) è un importante mediatore della plasticità a lungo termine indotta nel cervello dall'esposizione cronica a diversi tipi di stimoli psicoattivi, tra cui droghe di abuso, stress e convulsioni elettroconvulsive . Una caratteristica distinta di DeltaFosB è che, una volta indotta, persiste nel cervello per periodi di tempo relativamente lunghi in assenza di ulteriore stimolazione. I meccanismi alla base di questa apparente stabilità, tuttavia, sono rimasti sconosciuti. Qui, dimostriamo che DeltaFosB è un fattore di trascrizione relativamente stabile, con un'emivita di circa 10 h nella coltura cellulare. Inoltre, mostriamo che DeltaFosB è una fosfoproteina nel cervello e che la fosforilazione di un residuo di serina altamente conservato (Ser27) in DeltaFosB lo protegge dalla degradazione del proteasomal. Forniamo diverse linee di evidenza che suggeriscono che questa fosforilazione è mediata dalla caseina chinasi 2. Questi risultati costituiscono la prima prova che DeltaFosB è fosforilato e dimostrano che la fosforilazione contribuisce alla sua stabilità, che è al centro della sua capacità di mediare adattamenti duraturi nel cervello.
Introduzione
Il fattore di trascrizione ΔFosB, anch'esso designato FosB2 o FosB [forma breve], è una variante di splicatura troncata del gene immediato immediato C FosB (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu e Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Come FosB a lunghezza intera, ÀFosB ha un dominio di base che lega il DNA e una cerniera di leucina attraverso il quale si dimeri con le proteine Jun per formare complessi di fattori di trascrizione della proteina attivatore-1 (AP-1), che regolano l'espressione di molti geni (Morgan e Curran, 1995; Rylski e Kaczmarek, 2004). Nonostante manchi una parte del dominio di transattivazione trovato nel capolinea C di FosB, ΔFosB funziona sia come potente attivatore trascrizionale che come repressore nelle cellule in coltura e nel cervello (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu e Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung e Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB è indotto ad alti livelli in un modo specifico della regione nel cervello dopo esposizione cronica, ma non acuta, a una varietà di stimoli psicoattivi, tra cui lo stress, alcune lesioni, farmaci antipsicotici e antidepressivi, droghe d'abuso e premi naturali (Hope et al., 1994b; Hiroi e Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). L'induzione di ΔFosB è stata correlata direttamente agli effetti funzionali di molti di questi stimoli sul cervello. La persistenza di ΔFosB anche in assenza di stimolazione aggiuntiva la distingue da tutti gli altri fattori di trascrizione della famiglia Fos, che sono indotti rapidamente in risposta a stimoli acuti, decadono ai livelli basali entro poche ore e generalmente mostrano desensibilizzazione dopo stimolazione cronica (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi e Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Ciò rende ΔFosB un candidato attraente per mediare alcuni dei cambiamenti duraturi nell'espressione genica che sono alla base degli adattamenti neuronali stabili causati da determinati stimoli cronici.
Poiché la presenza prolungata di ΔFosB avviene in assenza di ulteriore induzione del suo mRNA (Chen et al., 1995), abbiamo ipotizzato che, a differenza del FosB a tutta lunghezza e di tutte le altre proteine della famiglia Fos, che sono intrinsecamente instabili, ΔFosB può essere un fattore di trascrizione insolitamente stabile (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Inoltre, l'analisi immunoblotting del tessuto cerebrale stimolato acuto-cronico ha suggerito che ΔFosB si sposta in apparente Mr (massa molecolare) da ~33 kDa nella condizione acuta a ~35-37 kDa durante il trattamento cronico (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Poiché non ci sono prove per l'esistenza di ulteriori mRNA che potrebbero codificare per queste varie isoforme, abbiamo ulteriormente ipotizzato che ΔFosB sia modificato post-traduzionale e che forse ciò contribuisca alla sua insolita stabilità. Ad oggi, tuttavia, non sono state riportate analisi biochimiche del turnover o delle modifiche post-traduzionali di ΔFosB. L'obiettivo del presente studio era di determinare se ΔFosB fosse una fosfoproteina e se la fosforilazione avesse un ruolo nella sua stabilità.
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Materiali e Metodi
Linee cellulari dei mammiferi e costrutti del DNA.
Cellule PC12 (Clontech, Mountainview, CA) sono state coltivate in DMEM ad alto glucosio contenente l-glutammina (L-Gln) e integrate con siero bovino fetale 5% (FBS), siero di cavallo 10% (entrambi da Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml di penicillina e 100 μg / ml di streptomicina (entrambi di Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Le cellule HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) sono state coltivate in DMEM ad alto glucosio contenenti L-Gln e integrate con 10% FBS, penicillina e streptomicina. Entrambe le linee cellulari sono state mantenute a 37 ° C in un 5% CO umido2 atmosfera.
Per le trasfezioni transitorie con DNA, PC12 o HeLa cellule sono state seminate su piastre da sei pozzetti (rivestite con collagene I per cellule PC12) in modo da raggiungere la confluenza di 90-100 il giorno successivo e sono state quindi trasfettate usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). In alcuni esperimenti (vedi Figg. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB è stato transitoriamente espresso nelle cellule PC12 attraverso l'infezione da virus dell'herpes simplex ricombinante (HSV).
I cDNA di ÀFosB e FosB sono stati ottenuti dai nostri propri costrutti pTetop (Chen et al., 1997) e subclonati in un vettore pcDNA3.1 (Invitrogen). Questi costrutti pcDNA3.1-ΔFosB / FosB sono stati utilizzati per l'espressione in cellule di mammifero e come modello per la mutagenesi sito-diretta. L'HSV-ΔFosB ricombinante è stato preparato come descritto in precedenza (Neve et al., 1997), e la preparazione aveva un titolo di ~1 × 108 pfu / ml.
Esperimenti a caccia di impulsi.
Circa 24 h dopo infezione / transfezione, le cellule (PC12 o HeLa) in piastre da sei pozzetti sono state lavate due o tre volte con 2 ml di PBS e incubate a 37 ° C per ~1 h in 2 ml di DMEM privo di Metri / Met. (Invitrogen) integrato con 5% dializzato FBS (Hyclone, Logan, UT) per esaurire i pool intracellulari di Met e Cys. Alla fine di questo periodo di "fame", i farmaci (se le cellule dovevano essere trattate) sono stati aggiunti e le cellule sono state etichettate (impulso) con 12-25 μCi di 35Mix di etichettatura proteica S (PerkinElmer, Wellesley, MA) per ~1 h a 37 ° C per etichettare tutte le proteine appena sintetizzate. Il radiomarcato è stato quindi rimosso lavando le cellule due o tre volte con 2 ml di PBS e il 35Le proteine marcate con S sono state seguite (chase) sostituendo il terreno con terreno "freddo" (non radioattivo) integrato con 5% FBS e raccogliendo le cellule in vari punti temporali. I trattamenti cellulari sono stati mantenuti durante l'inseguimento. Tutte le figure di questi esperimenti mostrano quantità iniziali simili delle varie proteine per ottimizzare i confronti dei loro tassi di turnover.
Animali e trattamento convulsivo elettroconvulsivo cronico.
Ratti maschi adulti Sprague Dawley (200-300 g, Charles River Laboratories, Kingston, RI) sono stati trattati una volta al giorno con convulsioni elettroconvulsive (ECS) per 7-9 d. ECS è stato eseguito come descritto in precedenza (Hope et al., 1994a) utilizzando un Ugo Basile (Comerio VA, Italia) Unità ECS con le seguenti impostazioni: frequenza, 100 impulsi / s; impulso con, 0.5 ms; durata dell'urto, 1.0 s; e corrente, 75 mA. Gli animali di controllo sham venivano trattati in parallelo applicando gli elettrodi a clip senza alcuna corrente elettrica.
32 P etichettatura metabolica.
Per l'etichettatura delle fette di cervello, i ratti sono stati decapitati, il cervello rapidamente sezionato e le fette corticali frontali 300 μm sono state preparate con un microslicatore DSK (Ted Pella, Redding, CA). Le fette sono state incubate all'interno di tubi di plastica in 2 ml di CSF artificiale povero di fosfato (ACSF) e mantenute a 30 ° C sotto costante bubbling delicato con una O2/ CO2 miscela (Hemmings et al., 1989). Le fette (due fette per provetta) sono state etichettate con 1.3 mCi per 8-10 h in presenza o assenza di acido okadaico (100 ng / ml). Al termine di questa incubazione, le fette sono state risciacquate almeno tre volte con ACSF freddo e poi omogeneizzate mediante sonicazione in 250 μl di tampone di dosaggio freddo radioimmunoprecipitazione (PIP), pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v Igepal, 0.5% (p / v) di sodio desossicolato, 0.1% (p / v) SDS, 1 mm EDTA] supplementato prima dell'uso con SDS fino a 0.6%, cocktail di inibitore della proteasi per cellule di mammifero (utilizzato a 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), cocktail I inibitori della fosfatasi I e II (utilizzati in 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF e 2% glicerolo. Gli omogenati sono stati poi bolliti per 15 min e eliminati mediante centrifugazione su 15,000 × g per 15 min. La concentrazione di proteine nei supernatanti risultanti è stata valutata utilizzando il test della proteina BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Per la 32Etichettatura P delle cellule in coltura, ~24 h dopo l'infezione / trasfezione, le cellule sono state lavate due o tre volte con terreno privo di fosfati e incubate in questo terreno per ~1 h. Dopo questo periodo di inedia, 0.2-0.3 mCi di 32PH3PO4 (PerkinElmer) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e le celle sono state etichettate per 4-12 h a seconda del tipo di esperimento (vedere Fig. 1-7 per le specifiche). Le cellule sono state quindi lavate tre volte con PBS e lisate su ghiaccio per 15 min con 50 μl di tampone RIPA integrato. I lisati sono stati raccolti mediante raschiatura e sono stati passati 10 volte attraverso un ago 25 ga per tagliare il DNA, bollito per 10 min e centrifugato a 15,000 rpm per 15-30 min a 4 ° C. I lisati chiarificati (supernatanti) sono stati trasferiti in una nuova provetta e un saggio proteico BCA (Pierce) è stato eseguito. Tutte le figure di questi esperimenti mostrano quantità simili di proteine totali di tipo selvatico (WT) e S27A ΔFosB per ottimizzare i confronti dei loro livelli relativi di fosforilazione.
Prodotti chimici e trattamenti di coltura cellulare.
L'acido okadaico (OA; Sigma-Aldrich) è stato sciolto in etanolo e utilizzato ad una concentrazione finale di 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosil-benzimidazolo (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO; Sigma-Aldrich) e utilizzato in coltura cellulare ad una concentrazione finale di 50 μm. Spermine (Sigma-Aldrich) è stato sciolto in acqua e utilizzato a una concentrazione finale di 200 μm. Calphostin-C (Biomol) è stato sciolto in DMSO e utilizzato a 0.2 μm, mentre il fenobol 12-miristato 13-acetato (PMA, Promega, Madison, WI) è stato sciolto in DMSO e utilizzato a 0.1 μm. il peptide inibitore miristoilato-autocamtide-2-correlato (m-AIP; Biomol) è stato sciolto in acqua e utilizzato a una concentrazione finale di 1 e 10 μm. Gli inibitori della chinasi della proteina ad ampio spettro H-7 e H-8 (Biomol) sono stati sciolti in acqua e utilizzati ad una concentrazione finale di 150 e 200 μm, rispettivamente. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) ed epossomicina (Peptides International, Louisville, KY) sono stati entrambi sciolti in DMSO e utilizzati a una concentrazione finale di 12.5 e 7.5 μm, rispettivamente. In tutti gli esperimenti, DMSO (veicolo) è stato aggiunto alle cellule come necessario per mantenere una quantità costante di DMSO tra i trattamenti. Per 32Gli esperimenti di etichettatura P, i farmaci sono stati aggiunti immediatamente prima dell'etichetta e conservati per il restante periodo di etichettatura. Per gli esperimenti con inseguitori di impulsi, i farmaci sono stati aggiunti al momento della "fame" di Cys / Met, mantenuti durante il periodo di etichettatura e poi aggiunti nuovamente nel mezzo dell'inseguimento. Gli inibitori del proteasoma sono stati addizionati con ogni 3-4 h durante l'inseguimento per compensare il rapido turnover di questi peptidi.
Immunoprecipitazione ΔFosB, immunoblotting e autoradiografia.
Per le immunoprecipitazioni, i lisati sono stati diluiti con 1: 5 con normale RIPA per portare la concentrazione di SDS fino a 0.1% prima di procedere con l'immunoprecipitazione (IP). Per limitare il legame non specifico, i lisati sono stati preventivamente eliminati mediante immunoprecipitazione con IgG non immunitarie e proteina G-Sepharose (Sigma-Aldrich) per almeno 4 h. ΔFosB è stato quindi immunoprecipitato dai lisati chiarificati usando un anticorpo policlonale di capra che riconosce un epitopo interno presente sia in FosB che in ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a 0.5-1 μg IgG per 10 μg di proteina lisato (50-300 μg di proteine totali) in un volume totale di 0.5 ml. Gli IP sono stati delicatamente miscelati a 4 ° C su un rotore per almeno 8 he sono stati aggiunti 15 μl di proteina G-Sepharose e gli IP sono stati miscelati per almeno un altro 4 h. Gli IP sono stati eliminati ruotando su 3000 × g per 3-5 min a 4 ° C, lavato tre volte con 0.5 ml di RIPA freddo normale e due volte con PBS freddo contenente 0.1% Tween 20. Gli IP sono stati quindi risospesi in 0.5 ml di PBS freddo, trasferiti, pellettati in una nuova provetta, e le proteine immunoprecipitate sono state quindi eluite mediante l'aggiunta di 15-25 μl di 2 × riducendo il buffer del campione di proteine Laemmli. Questo protocollo IP ha prodotto la precipitazione specifica ed effettiva di quasi tutto il ΔFosB nel lisato. Le proteine immunoprecipitate sono state sottoposte a SDS-PAGE caricando l'intero IP su un gel 12.5% Tris-HCl Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA) e quindi trasferite su PVDF o nitrocellulosa. Dopo il trasferimento, la membrana è stata asciugata all'aria e 32P- e 35Le bande proteiche con radiotrasmissione S sono state osservate mediante autoradiografia utilizzando il film autoradiografico Kodak (Rochester, NY), nonché mediante fosforescenza utilizzando un fosforoImager Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Il ΔFosB totale (non fosforilato e fosforilato) nei lisati cellulari o negli omogenati del cervello è stato rilevato mediante immunoblotting della proteina immunoprecipitata (utilizzando la stessa membrana utilizzata per rilevare 32Proteina marcata con P) o di pari quantità di proteina lisato / omogenato sottoposta a SDS-PAGE e trasferita su PVDF o nitrocellulosa. La membrana è stata prima bloccata incubandola con 1% (p / v) di latte secco senza grassi (Bio-Rad) in PBS integrato con 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) per 1 h a 25 ° C. La membrana è stata quindi sottoposta a immunoblotting durante la notte a 4 ° C con il nostro anticorpo policlonale anti-FosB generato contro gli aminoacidi 1-16 di FosB / ΔFosB (utilizzato in 1: 10,000). Dopo l'incubazione primaria, le membrane sono state lavate quattro volte per 5 min con tampone bloccante e quindi incubate a 25 ° C per ~1 h con una IgG anti-coniglio caprina coniugata con perossidasi di rafano (utilizzata a 1: 5000 in tampone bloccante, da Vector Laboratori, Burlingame, CA). Le membrane sono state quindi lavate tre volte per 10 min con tampone bloccante e una volta per 5 min con PBS. Le bande totali di ΔFosB sono state visualizzate su film Kodak MR mediante chemiluminescenza potenziata (Pierce) e / o mediante rilevazione di fluorescenza utilizzando i reagenti ECL-Plus (Amersham Biosciences) e il PhosphorImager a forma di tempesta.
Sovraespressione e purificazione del ΔFosB ricombinante da cellule di insetti.
ΔFosB è stato sovraespresso nelle cellule di insetto Sf9 come proteina N tag hexa-His (N-His (6) ΔFosB) utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen) e seguendo le istruzioni del produttore. In breve, il cDNA ΔFosB (residui 2-237) preceduto dal tag N-terminale di affinità MGHHHHHHHAG è stato sottoclonato nel vettore pFASTBacTM1, che è stato utilizzato per generare baculovirus ricombinante. Le cellule Sf9 sono state infettate con virus ricombinante e N-His (6) ΔFosB è stato purificato dai lisati cellulari mediante diverse fasi cromatografiche inclusa cromatografia di affinità utilizzando una colonna di nickel (Qiagen, Valencia, CA), scambio anionico utilizzando una colonna mono-Q (Amersham Bioscienze) e l'esclusione dimensionale utilizzando una colonna di gel-filtrazione (Amersham Biosciences).
In vitro studi di fosforilazione.
In vitro reazioni di fosforilazione per analisi del tempo e stechiometria sono state eseguite in un volume di 30 μl contenente substrato 10 μm (N-His (6) ΔFosB o un substrato di controllo positivo), 250 μm ATP e 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, il buffer fornito dal produttore della chinasi e una delle seguenti chinasi: CK2 (20 ng / μl, Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Stato superiore), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) o p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Le reazioni al decorso sono state eseguite rimuovendo le aliquote di 5 μl dalla soluzione di reazione nei punti temporali designati e aggiungendo un volume uguale di 4 × riducendo il tampone del campione di proteine Laemmli. I parametri cinetici di Michaelis-Menten per la reazione di CK2 sono stati determinati in condizioni di stato stazionario lineare definite empiricamente. Queste reazioni sono state eseguite per 15 min in un volume di 10 μl contenente enzima 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP e N-His (6) ΔFosB concentrazioni che vanno da 2.5-30 μm. Tutte le reazioni sono state eseguite a 30 ° C a bagnomaria. Dopo la SDS-PAGE e la colorazione del gel con Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), il gel è stato essiccato e 32L'incorporazione di P-fosfato è stata valutata mediante analisi di fosforescenza (vedi sotto, quantificazione dei dati, calcoli e statistiche).
Mappa del fosfopeptide bidimensionale e analisi del fosfoamino acido.
Entrambe queste analisi sono state eseguite come descritto da Ploegh and Dunn (2000). In breve, frammenti di gel secchi contenenti 32ΔFosB con etichetta P (o da in vitro reazioni o da immunoprecipitati di cellule con etichetta metabolica), sono stati asportati, reidratati, lavati e sottoposti a digestione triptica. Il surnatante contenente i prodotti di digestione triptica è stato liofilizzato e il liofilizzato lavato diverse volte e risospeso in 10 μl di tampone di elettroforesi, pH 1.9. Campione (3 μl) è stato individuato su una piastra per cromatografia a strato sottile (TLC) di cellulosa (Analtech, Newark, DE) e separato in una dimensione mediante elettroforesi e l'altra dimensione mediante TLC ascendente. Le mappe fosfopeptidiche risultanti sono state visualizzate mediante autoradiografia e fosforaggio. Per l'analisi del phosphoamino acid, 2 μl dei digestici triptici che erano stati risospesi in tampone per elettroforesi sono stati ulteriormente scissi mediante idrolisi dell'HCl a 105 ° C per 25 min in 3 m HC1 sotto una N2 atmosfera. La reazione è stata fermata da una diluizione di sei volte in acqua e la miscela è stata liofilizzata. Il liofilo è stato risospeso in 5 μl di tampone per elettroforesi, pH 1.9 e chiazzato su una piastra di TLC cellulosica insieme a standard fosfo-Ser, -Thr e -Tyr. L'elettroforesi è stata eseguita su metà della lunghezza della placca TLC utilizzando tampone per elettroforesi, pH 1.9, e quindi la piastra è stata trasferita nel tampone pH 3.5 ed è stata eseguita l'elettroforesi fino al completamento. Gli standard dell'acido fosfoamino sono stati visualizzati spruzzando la piastra TLC con una soluzione di 1% (v / v) di ninidrina in acetone e 32Campioni di amminoacidi marcati con P sono stati visualizzati sia dall'autoradiografia che dal fosforo.
knock-down CK2α indotta da siRNA.
Abbiamo usato un metodo di interferenza RNA per abbattere selettivamente i livelli di CK2 (Di Maira et al., 2005). Le cellule PC12 sono state seminate su piastre a sei pozzetti rivestite di collagene I per raggiungere la confluenza di ~70-80% il giorno successivo, quando sono transiunte transitoriamente con 20 nm (concentrazione finale) di siRNA non mirante o siRNA diretto verso l'mRNA del catalitico subunità α di Rat CK2, utilizzando 5 μl dell'agente di trasfezione SilentFectin (Bio-Rad) e seguendo le istruzioni del produttore. Circa 24 h più tardi, le cellule sono state transfettate transitoriamente con il plasmide ΔFosB, come sopra indicato. Circa 24 h dopo (~48 h dopo trasfezione siRNA), le cellule sono state sottoposte a 32Etichettatura metabolica P o analisi dell'impulso-impulso come descritto sopra. I seguenti quattro siRNA CK2α sono stati utilizzati con risultati simili: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUUNUMX' (Dharmacon, Lafayette, CO). Come controllo negativo, abbiamo usato Silenziatore controllo negativo #3 siRNA di Ambion (Austin, TX). L'entità dell'abbattimento di CK2 è stata monitorata mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo policlonale anti-CK2 (catalogo # 06-873 da Upstate) durante la notte a una diluizione 1: 1000. La β-tubulina è stata utilizzata come controllo di carico e rilevata con un anticorpo monoclonale (catalogo # 05-661 da Upstate) durante la notte a una 1: diluizione 20,000.
Mutagenesi sito-diretta.
La mutazione di Ser27 in Ala o in Asp è stata eseguita utilizzando un kit di mutagenesi diretta al sito a cambio rapido (Stratagene, La Jolla, CA) e seguendo le istruzioni del produttore. Per introdurre le mutazioni Ser27 nella proteina ΔFosB del topo, sono stati utilizzati i seguenti primer di mutagenesi. Ser27 to Ala: (reverse primer) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Da Ser27 a Asp (forward primer) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Le basi mutate sono in grassetto e il codone Ser27 è in corsivo.
Bioinformatica.
Potenziali siti di fosforilazione e chinasi per ΔFosB sono stati ricercati sottoponendo la sequenza proteica del mouse a database specializzati tra cui ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) e NetPhosK (Blom et al., 2004).
Quantificazione dei dati, calcoli e statistiche.
La quantità di proteina presente nella membrana di PVDF o nitrocellulosa è stata quantificata usando un fosforo a forma di tempesta e il software ImageQuant che accompagna (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Nella coltura cellulare e nel cervello si analizzano gli studi di fosforilazione, i valori ottenuti per il 32Le proteine marcate con P sono state quindi divise per i valori ottenuti per il totale ΔFosB e espresse come rapporto. Nel in vitro studi di fosforilazione, la quantità di 32ΔFosB marcato con P per mole di ΔFosB (stechiometria) è stato calcolato come descritto in precedenza (Sahin et al., 2004). Tutte le misure sono state prese all'interno del range di linearità dello strumento utilizzato. I parametri cinetici sono stati calcolati utilizzando il modello di Michaelis-Menten, per cui V = VMax[S] / ([S]+KM) e VMax = k2[ETotale]. L'emivita (t1/2) di ΔFosB e FosB sono stati stimati dai diagrammi di impulso-inseguimento (utilizzando la regressione non lineare che meglio misura i punti di dati) e corrispondono al momento in cui la quantità di proteina rimanente è 50% dell'originale. In tutte le figure, i risultati mostrati sono rappresentativi di almeno due o tre esperimenti indipendenti. In tutti i grafici, i dati visualizzati sono medie ± SEM (3 ≤ n ≤16). La significatività statistica delle differenze è stata valutata utilizzando uno spaiato t test, corretto per confronti multipli, e gli asterischi indicano p ≤ 0.05.
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Risultati
ΔFosB è un fattore di trascrizione insolitamente stabile
Sebbene in precedenza abbiamo ipotizzato che ΔFosB sia un fattore di trascrizione relativamente stabile (Nestler et al., 2001), non è stata eseguita fino ad oggi un'analisi diretta del profilo di turnover della proteina. Per rispondere a questa domanda, abbiamo condotto esperimenti con l'impulso pulsato utilizzando cellule PC12, che sono state ampiamente utilizzate come una linea cellulare simile a neuroni, in cui ΔFosB è stato espresso transitoriamente tramite infezione con un virus dell'herpes simplex ricombinante (HSV-ΔFosB). Le proteine appena sintetizzate sono state etichettate metabolicamente con 35S-Met / Cys e il modello di degrado di 35ΔFosB con etichetta S (35S-ΔFosB) è stato monitorato immunoprecipitandolo dai lisati cellulari ottenuti in vari punti temporali dopo la rimozione degli aminoacidi radiomarcati. L'analisi degli immunoprecipitati da SDS-PAGE e l'autoradiografia hanno rivelato che l'emivita di ΔFosB nelle cellule PC12 è ~10 h (Fig. 1). Questi risultati mostrano che l'emivita di ΔFosB è superiore a quella dei fattori di trascrizione più inducibili (vedi Discussione), incluso FosB a lunghezza intera, la cui emivita nella coltura cellulare è stata segnalata in ~90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Inoltre, vale la pena notare che la degradazione di ΔFosB non si adatta a una curva di decadimento esponenziale di primo grado, ma piuttosto è bifasica, iniziando con una velocità di degradazione più lenta. Ciò suggerisce l'esistenza di più di una specie ΔFosB e / o più di un percorso di degradazione.
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Immagine 1.
ΔFosB è un fattore di trascrizione insolitamente stabile. L'emivita di ΔFosB è ~10 h nella coltura cellulare. ΔFosB è stato espresso in cellule PC12 da una infezione con HSV-ΔFosB o transfezione transitoria con plasmide contenente ΔFosB e le cellule sono state sottoposte a esperimenti con inseguitori di impulsi come descritto in Materiali e metodi. Risultati equivalenti sono stati ottenuti indipendentemente dal metodo utilizzato per sovraesprimere ΔFosB. La figura mostra il decorso temporale (e l'autoradiogramma rappresentativo) della degradazione del ΔFosB. I dati tracciati sono la media ± SEM di almeno 15 punti dati individuali ottenuti da almeno cinque esperimenti indipendenti. Per confronto, viene indicata l'emivita del FosB a lunghezza intera.
ΔFosB è una fosfoproteina nel cervello
Abbiamo ipotizzato che la modifica post traduzionale di ΔFosB possa contribuire alla sua apparente stabilità. Poiché la fosforilazione ha dimostrato di modulare l'attività dei fattori di trascrizione in molti modi, inclusa la loro stabilità (per la revisione, vedere Desterro et al., 2000; Whitmarsh e Davis, 2000), abbiamo studiato se ΔFosB è una fosfoproteina. A tal fine, l'espressione di ÀFosB è stata indotta nel cervello di ratto utilizzando ECS cronico, un trattamento noto per indurre livelli elevati di ΔFosB, in particolare nella corteccia frontale (Hope et al., 1994a). Un giorno dopo l'ultimo trattamento con ECS, quando i livelli di ΔFosB rimangono alti, sono state preparate sottili fette corticali frontali e etichettato metabolicamente con 32P-ortofosfato. Un insieme parallelo di fette non era marcato con il metodo radio, e questi erano usati per rilevare i livelli di ΔFosB totali. Dopo immunoprecipitazione con uno specifico anticorpo anti-FosB / ΔFosB e separazione delle proteine immunoprecipitate mediante SDS-PAGE, fosforilata 32Il ΔFosB marcato con P è stato rilevato dall'autoradiografia, mentre il totale ΔFosB è stato rilevato mediante immunoblotting. Questa analisi ha rivelato che ΔFosB è fosforilato nel cervello, come evidenziato da uno specifico 32La banda marcata con P di ~35 kDa è presente nei campioni cerebrali trattati cronicamente, ma è praticamente irrilevabile nei controlli trattati con sham (Fig. 2A). Ciò è coerente con il fatto che, in assenza di stimolazione cronica, i livelli basali di ΔFosB sono molto bassi. La specificità della reazione di immunoprecipitazione è illustrata dalla mancanza di segnale nel precipitato di IgG non immunitario.
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Immagine 2.
ΔFosB è una fosfoproteina nel cervello. A, ΔFosB è fosforilato nel cervello. Il ΔFosB endogeno è stato indotto nel cervello di ratto mediante trattamento ECS cronico come descritto in Materiali e metodi. Fette corticali frontali erano etichettate metabolicamente con 32PH3PO4 per diverse ore. Dopo omogeneizzazione delle fette, ΔFosB era immunoprecipitato e fosforylato ΔFosB (32P-ΔFosB) è stato rilevato dall'autoradiografia (pannello superiore). Il totale ΔFosB in immunoprecipitati non radioattivo è stato rilevato mediante immunoblotting (pannello inferiore). Come controlli negativi, vengono mostrati gli immunoprecipitati di un animale trattato con sham e di IgG non immunitarie. BI siti di fosforilazione candidata e le chinasi con i corrispondenti punteggi di predizione per la sequenza di proteine ΔFosB del topo sono stati ottenuti mediante analisi bioinformatica. I siti candidati con i punteggi di predizione più elevati sono evidenziati nella sequenza proteica e elencati nella tabella. Il dominio del DNA (base) e la cerniera della leucina sono in grassetto nella sequenza proteica. C, D, La fosforilazione di ΔFosB è aumentata dall'inibitore O / fosfatasi Ser / Th. C, 32I livelli di P-ΔFosB in immunoprecipitati da fette corticali frontali marcate in assenza (Ctr) o presenza di 100 ng / ml OA (grafico e pannello superiore) sono stati rilevati mediante autoradiografia. Il pannello inferiore mostra il totale ΔFosB rilevato in immunoprecipitati da sezioni non marcate mediante immunoblotting. D, Le cellule PC12 sono state infettate con HSV-ΔFosB o HSV-LacZ (vettore) e metabolicamente etichettate con 32PH3PO4 in assenza (Ctr) o presenza di 100 ng / ml OA. 32I livelli di P-ΔFosB in immunoprecipitati sono stati rilevati mediante autoradiografia (grafico, pannello superiore). Il pannello inferiore mostra il totale ΔFosB rilevato nei lisati cellulari mediante immunoblotting.
Come primo passo per chiarire quale / i kinasi / e sito / i sono coinvolti nella fosforilazione di ΔFosB, abbiamo sottoposto la sua sequenza di amminoacidi a diverse analisi bioinformatiche. Ciò ha rivelato che, sebbene ΔFosB non contenga siti candidati per la fosforilazione di Tyr, contiene diversi siti di consenso della chinasi Ser / Thr, inclusi tre siti CaMKII, tre siti CK2 e due siti PKC con punteggi di previsione della fosforilazione molto alti (Fig. 2B). Se, come previsto attraverso la bioinformatica, ΔFosB è solo fosforilato su residui Ser o Thr, allora la sua fosforilazione dovrebbe essere significativamente modulata dall'attività di fosfatasi Ser / Thr. Per verificare questa ipotesi, abbiamo etichettato le fette corticali frontali con 32P-ortofosfato in presenza o assenza di OA, un inibitore della fosfatasi proteica Ser / Thr. Come mostrato in Figure 2 C, OA ha causato un notevole aumento (~2.5 volte) in 32P-ΔFosB. Ha anche causato un piccolo aumento dei livelli di ΔFosB totali, che è coerente con precedenti rapporti che collegano gli effetti cancerogeni di OA alla sua capacità di indurre diversi geni precoci immediati tra cui le proteine Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Il risultato netto è un aumento generale significativo (~60%) nei livelli di fosforylati ΔFosB.
Abbiamo quindi studiato se, nelle cellule PC12, che sono più suscettibili alla manipolazione sperimentale, ΔFosB ha mostrato un pattern di fosforilazione simile a quello osservato nel cervello. Abbiamo espresso ΔFosB nelle cellule PC12 attraverso l'infezione da HSV-ΔFosB e etichettato metabolicamente le cellule con 32P-ortofosfato in presenza o assenza di OA. L'espressione di successo e l'immunoprecipitazione della proteina da cellule infette da HSV-ÀFosB è dimostrata dalla presenza sia nell'immunoblot (Fig. 2D, pannello inferiore) e l'autoradiografo (pannello superiore) di una banda kDa ~35, assente nelle celle infette da vettori. Come osservato nel cervello, l'OA ha causato un piccolo aumento dei livelli di ÀFosB totali ma un aumento molto più elevato (circa due volte) 32P-ΔFosB, con conseguente aumento significativo (~50%) della fosforilazione di ΔFosB. Inoltre, in linea con le previsioni bioinformatiche, il trattamento delle cellule di PC12 con un inibitore della fosfatasi di Tyr non ha comportato cambiamenti significativi 32Livelli P-ΔFosB (dati non mostrati). Insieme, questi risultati hanno rivelato che ΔFosB è fosforilato su residui Ser e / o Thr nel cervello e nelle cellule PC12 e ha confermato quest'ultimo come un buon sistema di coltura cellulare in cui studiare ulteriormente i profili di fosforilazione e degradazione di ΔFosB.
CK2 ma non PKC o CaMKII fosforilati ΔFosB in vitro
Come descritto sopra, l'analisi della sequenza di ammino acidi ΔFosB ha rivelato punteggi di predizione elevati per i siti di fosforilazione di CK2, PKC e CaMKII. Per determinare quale di queste chinasi può fosforilare ΔFosB, abbiamo condotto una serie di in vitro reazioni di fosforilazione utilizzando chinasi purificate e ΔFosB ricombinante purificato. Come mostrato in Figure 3 A, delle tre chinasi candidate, solo CK2 fosforilata ΔFosB in modo significativo. Inoltre, sono state testate diverse altre chinasi (ad es. GSK3 e p70S6K), ma non sono riusciti a fosforilare in modo significativo ΔFosB (dati non mostrati). Caratterizzazione aggiuntiva della reazione CK2 mediante analisi del tempo trascorso ha rivelato che questa chinasi può catalizzare l'incorporazione di ~0.5 moli di fosfato per mole di ΔFosB (Fig. 3B). Il fatto che CK2 può fosforilare ΔFosB in vitro una notevole stechiometria (~50%) suggerisce una reazione fisiologicamente rilevante. Abbiamo quindi studiato la cinetica di questa reazione incubando CK2 in presenza di quantità crescenti di ΔFosB purificato, e abbiamo determinato che i fosforilati CK2 ΔFosB con un Vmax di 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 di enzima, a KM di 18.4 μm e a kgatto di 0.2 / s (Fig. 3C). I valori ottenuti per questi parametri cinetici supportano ulteriormente la rilevanza fisiologica di questa reazione. Ad esempio, il KM di CK2 per DARPP32, uno dei suoi substrati più noti, è 3.4 μm e kgatto è ~0.3 / s (Girault et al., 1989); il KM per gamme ATP da ~10-40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), e quello per casein varia da ~10-50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Insieme, questi dati indicano che ΔFosB è un substrato in buona fede per CK2 in vitro.
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Immagine 3.
CK2 ma non PKC o CaMKII fosforilati ΔFosB in vitro. L'autoradiografo (pannello superiore) mostra il prodotto fosforilato e il gel colorato con Coomassie (pannello inferiore) mostra un totale di ÀFosB presente nella reazione. AÈ stato sottoposto a ΔFosB ricombinante purificato in vitro fosforilazione di varie chinasi candidate (tre delle quali sono mostrate). B, Analisi del tempo e analisi stechiometriche indicano che CK2 può fosforilare ΔFosB in vitro con una stechiometria di ~50%. CL'analisi cinetica della reazione di CK2 ha rivelato che ΔFosB è una buona fede in vitro substrato. La linearizzazione della reazione è mostrata in una trama doppia-reciproca (in basso), ma i parametri cinetici sono derivati dalla curva di Michaelis-Menten (in alto).
CK2 modula la fosforilazione e la stabilità di ΔFosB nelle cellule intatte
Per valutare la rilevanza fisiologica della fosforilazione mediata da CK2 di ΔFosB, abbiamo condotto una mappatura comparativa del fosfopeptide usando in vitro fosforilato e PC12-cell-fosforilato ΔFosB. Dopo SDS-PAGE e gel elution di 32P-ΔFosB (dal in vitro reazioni o dall'immunoprecipitato di 32Cellule P-marcate), la proteina è stata digerita con tripsina e i fosfopeptidi risultanti sono stati sottoposti a separazione bidimensionale. Questa analisi ha rivelato che il fosfopeptide principale della reazione di CK2 è stato comigrato con uno dei due principali fosfopeptidi da ΔFosB fosforilati in cellule PC12 (Fig. 4A), mentre i fosfopeptidi risultanti dalla reazione di PKC o CaMKII (dati non mostrati) no. C'era un secondo fosfopeptide ΔFosB presente nella mappa da cellule PC12, ma a causa dell'incapacità di una qualsiasi delle chinasi che abbiamo testato per generare un fosfopeptide simile in vitro, al momento non sappiamo se questo secondo fosfopeptide contiene un sito di fosforilazione diverso dall'altro fosfopeptide o se rappresenta un peptide trittico distinto che contiene lo stesso sito di fosforilazione.
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Immagine 4.
CK2 modula la fosforilazione e la stabilità di ΔFosB nelle cellule intatte. A, CK2 ma non PKC sembra fosforilare ΔFosB nelle cellule. Mappe fosfopeptidiche bidimensionali di ΔFosB fosforilate da CK2 o PKC in vitro o da cellule intere PC12. Le frecce mostrano la comigrazione del peptide fosforilato CK2 ma non quello fosforilato di PKC con uno dei fosfopeptidi ΔFosB ottenuti da cellule PC12. BLa fosforilazione di ΔFosB nelle cellule di PC12 è aumentata trattando le cellule con il potente attivatore CK2 spermine (SP) e diminuite con il trattamento con l'inibitore di CK2 DRB. Al contrario, la fosforilazione di ΔFosB nelle cellule PC12 non è stata influenzata dal trattamento con un attivatore PKC (PMA) o l'inibitore specifico della PKC calphostin-C (Calph). Vengono visualizzati un autoradiogramma rappresentativo (pannello superiore) e immunoblot (pannello inferiore). C-F, Effetto dell'attività CK2 sulla stabilità ΔFosB. Le figure mostrano il decorso temporale (e l'autoradiogramma rappresentativo) della degradazione del ΔFosB. Le cellule PC12 che esprimono transitoriamente ΔFosB sono state sottoposte a esperimenti con inseguitori di impulsi condotti in assenza o presenza dell'inibitore CK2 DRB (C), l'attivatore CK2 spermine (D), o l'inibitore della chinasi ad ampio spettro H-8 (E), che è stato usato per controllare gli effetti non specifici del DRB. F, Effetto di abbattere la subunità catalitica di CK2 sulla stabilità ΔFosB. Le cellule PC12 sono state trasfettate con un siRNA non bersaglio (Ctr) o con un ratto di targeting siRNA CK2α e 24 h successivamente trasfettate con un plasmide ΔFosB. Il pannello superiore raffigura immunoblots di lisati di cellule intere che mostrano l'effetto del siRNA di CK2 sui livelli di CK2 e ΔFosB della proteina. Il corrispondente immunoblot per la β-tubulina viene mostrato come controllo di caricamento.
Per approfondire la rilevanza fisiologica di CK2 come una chinasi ΔFosB, abbiamo trattato cellule ΔFosB che esprimono PC12 con due farmaci che modulano l'attività di CK2. Come mostrato in Figure 4 BLa fosforilazione di ΔFosB è stata ridotta dal trattamento delle cellule di PC12 con l'inibitore CK2 DRB permeabile alle cellule (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) e aumentata dal trattamento con la poliammina spermina, noto per essere un potente attivatore CK2 (Cochet e Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Al contrario, il trattamento delle cellule di PC12 con l'inibitore della PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) o l'attivatore PKC PMA (Schmidt e Hecker, 1975; Beh et al., 1989) non ha comportato cambiamenti significativi nella fosforilazione di ΔFosB. Nel caso della PMA, il leggero (e non significativo) aumento in 32P-ΔFosB potrebbe essere rappresentato da un aumento dei livelli di ΔFosB totali causati da questo farmaco; infatti, è stato riportato che gli esteri del forbolone inducono l'espressione di diverse proteine della famiglia Fos, incluso FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Inoltre, trattamento di cellule con l'inibitore CaMKII permeabile alla cellula m-AIP (Ishida e Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) inoltre non ha comportato una diminuzione della fosforilazione di ΔFosB (dati non mostrati). Insieme, questi risultati sono coerenti con i nostri in vitro risultati e indicano che nelle cellule intatte ΔFosB è probabile fosforilata da CK2 ma non da PKC o CaMKII. Il fatto che l'inibizione di CK2 non impedisca completamente la fosforilazione di ΔFosB indica l'esistenza di ulteriori siti di fosforilazione nella proteina.
Successivamente abbiamo esaminato se CK2 ha un ruolo nel turnover di ΔFosB e quindi nella sua stabilità. A tal fine, abbiamo condotto esperimenti con inseguitori di impulsi utilizzando cellule di PC12 che esprimono ΔFosB trattate con l'inibitore CK2 o con l'attivatore CK2 utilizzato nello studio di fosforilazione. Come mostrato in Figure 4 C, il trattamento delle cellule con l'inibitore CK2 DRB ha avuto un effetto significativo sul tasso di turnover di ΔFosB, evidenziato dal cambiamento di forma della sua curva di degradazione, da bifasico a una curva più vicina a quella di un decadimento esponenziale. Al contrario, la presenza dell'attivatore CK2 spermina ha causato una significativa diminuzione del tasso di degradazione di ΔFosB, che ha portato all'accumulo della proteina durante le prime ore di inseguimento (Fig. 4D).
Come nel caso di molti attivatori e inibitori della chinasi, spermine e DRB possono avere effetti metabolici al di fuori della modulazione dell'attività di CK2. Infatti, è stato dimostrato che il DRB inibisce la chinasi associata al fattore di trascrizione IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), che risulta nell'inibizione della trascrizione mediata da RNA polimerasi II. Poiché questo effetto potrebbe influenzare la stabilità di ΔFosB, abbiamo analizzato l'effetto dell'inibitore della chinasi ad ampio spettro H-8 (Hidaka e Kobayashi, 1992) sul turnover del FOSB ad una concentrazione (200 μm) nota per inibire la chinasi associata a TFIIH ma non CK2 (Yankulov et al., 1995). Come mostrato in Figure 4 E, il trattamento con H-8 non ha influenzato il tasso di turnover di ΔFosB. Risultati simili sono stati ottenuti con H-7, un altro inibitore della chinasi ad ampio spettro, utilizzato ad una concentrazione che inibisce la chinasi associata a TFIIH ma non CK2 (dati non mostrati). Questi dati supportano ulteriormente l'interpretazione che la riduzione della stabilità ΔFosB causata dal DRB è molto probabilmente attribuibile all'inibizione di CK2.
Per stabilire ulteriormente il ruolo di CK2 nel turnover ΔFosB, abbiamo studiato le conseguenze di abbattere CK2 tramite siRNA. Abbiamo eseguito questi esperimenti utilizzando cellule PC12 che sono state trasfettate per la prima volta con siRNA non retinico o siRNA che bersaglia l'mRNA della subunità catalitica del ratto CK2 (CK2α) e 24 h successivamente trasfettate con ΔFosB. Come mostrato in Figure 4 F, transfezione con siRNA CK2α in modo efficiente e specificamente abbattuto i livelli di proteina CK2α senza influenzare i livelli di ΔFosB (pannello superiore). L'analisi dell'impulso-inseguimento ha rivelato che abbattere CK2 ha comportato un aumento significativo del tasso di turnover ΔFosB come evidenziato dal più rapido degrado della proteina. Il fatto che inibendo l'attività di CK2 (tramite trattamento DRB o siRNA) aumenta il turnover di ΔFosB e determina la scomparsa della componente a velocità lenta della curva bifasica, mentre l'attivazione di CK2 migliora la fase lenta della curva, fornisce un forte supporto per l'idea che CK2 abbia un ruolo nella regolazione della stabilità di ΔFosB.
CK2 fosforilati ΔFosB su Ser27
Per iniziare a identificare i siti su ΔFosB fosforilati da CK2, abbiamo condotto l'analisi del fosfoammino acido di ΔFosB ricombinante fosforilata da CK2 in vitro e di ΔFosB fosforilati in cellule PC12. Questi esperimenti hanno rivelato che, in entrambi i casi, l'unico fosfo-amminoacido rilevato era fosfo-Ser (Fig. 5A). Questo risultato, insieme alla stechiometria ottenuta per il CK2 in vitro reazione di fosforilazione (~50%) (Fig. 3B) e la presenza di un solo punto significativo sulla mappa del fosfopeptide CK2 (Fig. 4A), suggerisce che la fosforilazione di CK2 di ΔFosB è probabilmente limitata a un singolo residuo di serina. Questa conclusione è coerente con l'analisi del sito di consenso alla fosforilazione (Fig. 2B), che prevedeva solo una candidata serina, cioè Ser27, per CK2. L'analisi tassonomica ha rivelato che Ser27 è altamente conservato attraverso l'evoluzione tra i membri della famiglia Fos (Fig. 5B), suggerendo che potrebbe sopportare un'importante funzione fisiologica.
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Immagine 5.
CK2 fosforilati ΔFosB su Ser27. A, Analisi dell'acido fosfoamminico di CK2-fosforilata (in vitro) e PC12 ΔFosB fosforilato da cellule che mostra che, in entrambi i casi, il principale residuo fosforilato è la serina. BL'analisi cross-specie della sequenza aminoacidica FosB / ÀFosB ha rivelato un'elevata conservazione di Ser27 tra i membri della famiglia Fos dall'essere umano a zebrafish (evidenziazione scura). Tuttavia, il residuo acido in posizione + 3, che è richiesto per il sito di consenso CK2, non è conservato (evidenziatore di luce). CLe cellule HeLa sono state transiunte transitoriamente con ΔFosB (WT) wild-type o ΔFosB contenenti una mutazione puntiforme per sostituire Ser27 con Ala (S27A). Le cellule erano etichettate metabolicamente con 32PH3PO4 e trattati con veicolo o con spermine (SP) per attivare CK2. Un autoradiogramma rappresentativo (pannello superiore) e immunoblot (pannello inferiore) degli immunoprecipitati ΔFosB ottenuti sono mostrati. Viene mostrato l'immunoprecipitato di cellule simulate-transfettate (vettore).
Per determinare se Ser27 è fosforilato in ΔFosB, abbiamo mutato questo residuo in Ala e analizzato le conseguenze sullo stato di fosforilazione della proteina. A tal fine, abbiamo utilizzato celle HeLa (che possono essere trasfettate con maggiore efficienza) per esprimere transitoriamente il mutante ΔFosB di WT o S27A. Circa 24 h dopo la trasfezione, le cellule sono state etichettate metabolicamente con 32Sono stati preparati P-ortofosfato e lisati di cellule intere. Dopo immunoprecipitazione e SDS-PAGE, 32P-ΔFosB è stato rilevato mediante autoradiografia e ΔFosB totale mediante immunoblotting. Come mostrato in Figure 5 C (pannello in basso), ΔFosB non è stato rilevato nelle cellule trasfettate con vettori, mentre le cellule trasfettate con mutante WT o S27A ΔFosB hanno espresso con successo la proteina. Abbiamo scoperto che la mutazione S27A ha causato una significativa riduzione (~30%) in 32P-ΔFosB livelli (Fig. 5C, pannello superiore e grafico), indicando che nelle cellule viventi, ΔFosB è fosforilato su Ser27. Nel tentativo di stabilire se in cellule Ser27 sia effettivamente fosforilata da CK2, abbiamo confrontato la capacità dell'attivatore CK2 spermine di modulare la fosforilazione di WT e S27A ΔFosB. Come avevamo osservato precedentemente nelle cellule PC12 (Fig. 4B), il trattamento delle cellule HeLa con spermina ha aumentato significativamente la fosforilazione della proteina WT. Il fatto che questo effetto sia stato significativamente ridotto dalla mutazione S27A (Fig. 5C) supporta l'interpretazione che Ser27 in ΔFosB è un substrato fisiologico per CK2.
La fosforilazione di Ser27 regola la stabilità di ΔFosB
Avendo stabilito che la stabilità di ΔFosB è diminuita quando CK2 è inibito e potenziato quando CK2 è attivato (Fig. 4), e quella fosforila CK2 ΔFosB su Ser27 (Fig. 5), abbiamo previsto che prevenire la fosforilazione di questo sito dovrebbe destabilizzare la proteina. Gli esperimenti di impulso-chase condotti con cellule HeLa che esprimono transitoriamente mutante WT o S27A ΔFosB hanno rivelato che, come previsto, la mutazione S27A ha provocato un aumento significativo della velocità di degradazione di ΔFosB e una concomitante diminuzione dell'emivita della proteina (Fig. 6A). Abbiamo quindi studiato se questo meccanismo di regolazione si verifica anche nella linea cellulare PC12 più simile a neurone. Questi esperimenti hanno rivelato che, come abbiamo osservato nelle cellule HeLa, la mutazione del punto S27A provoca una drastica diminuzione dell'emivita di ΔFosB nelle cellule PC12 (da ~11 a ~4 h) (Fig. 6B). Il fatto che questa destabilizzazione sia simile a quella causata dall'inibizione o dal knock-down di CK2 (Fig. 4) fornisce ulteriore supporto all'idea che la fosforilazione mediata da CK2 di Ser27 regoli la stabilità di ΔFosB. Ulteriori prove per il ruolo normativo della fosforilazione di Ser27 sul turnover della proteina ΔFosB sono state ottenute utilizzando una mutazione fosfomimetica da Ser27 a Asp (S27D). La mutazione S27D è considerata fosfomimetica, poiché colloca un grande gruppo (carbossilico) caricato negativamente all'amminoacido 27 e quindi imita in parte la fosforilazione di Ser27. Come mostrato in Figure 6 C, la mutazione S27D ha causato l'effetto opposto della mutazione S27A e ha prodotto una proteina significativamente più stabile della proteina WT. Analogamente all'effetto ottenuto dopo l'attivazione di CK2 (Fig. 4D), la mutazione S27D ha provocato l'accumulo e quindi ha aumentato i livelli di ΔFosB durante le prime ore di inseguimento.
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Immagine 6.
La fosforilazione di Ser27 regola la stabilità di ΔFosB. A, C, Analisi della sequenza di impulsi che mostra l'effetto della fosforilazione di Ser27 sul tasso di turnover di ΔFosB. Vengono mostrati il profilo di degradazione e l'emivita stimata di ΔFosB wild-type (WT), il mutante Ser27 in Ala (S27A) e il fosfomimetico Ser27 in mutante di Asp (S27D). Gli stessi risultati sono stati ottenuti nelle cellule HeLa (A) e le celle PC12 (B, C).
La fosforilazione di Ser27 stabilizza il ΔFosB prevenendo la sua degradazione proteasomale
Per iniziare a chiarire il meccanismo mediante il quale la fosforilazione di Ser27 stabilizza ΔFosB, abbiamo esaminato la capacità degli inibitori del proteasoma MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) ed epoxomicina (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) per modulare la velocità di degradazione del mutante WF e S27A ΔFosB. Gli esperimenti di impulse-chase sono stati condotti utilizzando cellule PC12 infettate con un HSV ricombinante che esprimeva o WT o S27A ΔFosB e trattati con DMSO o con uno dei due inibitori del proteasoma. Questi esperimenti hanno rivelato che sebbene il tasso di degradazione della proteina WT sia relativamente insensibile alla presenza di uno dei due inibitori del proteasoma (Fig. 7A), quello del mutante S27A è sensibile a questi farmaci (Fig. 7B). Ciò indica che, a differenza della proteina WT, il mutante S27A è un obiettivo di degradazione del proteasomal. Infatti, il trattamento delle cellule con MG132 o epoxomicina ha completamente invertito l'effetto della mutazione S27A sulla velocità di degradazione di ΔFosB, evidenziato da un aumento nell'emivita del mutante S27A da ~4 a ~9 h per MG132 e in ~ 12 h per epoxomicina (Fig. 7B). Insieme, questi risultati indicano che la fosforilazione di ΔFosB su Ser27 protegge la proteina dalla degradazione del proteasomal ed è quindi essenziale per la sua insolita stabilità.
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Immagine 7.
La fosforilazione di Ser27 stabilizza ΔFosB prevenendo la sua degradazione proteasomale. A, BAnalisi dell'impulso-impulso con cellule PC12 infette da HSV che mostrano il profilo di degradazione e l'emivita stimata di ΔFosB di tipo selvatico (A) o S27A ΔFosB (B) in assenza o presenza di uno dei due inibitori del proteasoma [MG132 ed epoxomicin (Epoxo)]. Si noti il fatto che nessuno dei due farmaci ha un effetto significativo sul turnover di ΔFosB wild-type, mentre il trattamento di cellule con inibitore del proteasoma ha portato alla stabilizzazione di S27A ΔFosB. C, Un modello per il ruolo della fosforilazione di Ser27 nella capacità di ΔFosB di mediare la plasticità cerebrale a lungo termine. Una volta indotta, una porzione di ΔFosB è stabilizzata nel cervello dalla fosforilazione mediata da CK2 di S27. Ciò si traduce nella sua accumulazione, che a sua volta provoca cambiamenti di lunga durata nell'espressione genica. Questi cambiamenti stabili nell'espressione genica contribuiscono a adattamenti comportamentali stabili. Al contrario, la defosforilazione di S27 da parte della fosfatasi Ser / Thr PP1 e / o PP2A determina la destabilizzazione della proteina e la sua elaborazione da parte del macchinario proteasomale.
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Discussione
Nel presente studio, mostriamo che ΔFosB ha un'emivita di ~10 h nella coltura cellulare, che lo rende stabile rispetto al FosB a lunghezza intera e alla maggior parte degli altri fattori di trascrizione inducibili, le cui emivite nella coltura cellulare possono essere altrettanto brevi come pochi minuti e raramente supera 3 h (Hann e Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts e Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Inoltre, riteniamo che ΔFosB sia fosforilato nel cervello e che la sua fosforilazione sia sensibile all'inibitore okadaico dell'inibitore PP1 / PP2A. I nostri studi sulle colture cellulari dimostrano che la stabilità di ΔFosB è modulata da CK2, con una maggiore attività di CK2 che stabilizza la proteina. Infine, i nostri risultati suggeriscono che le fosforilazioni CK2 ΔFosB su una serina terminale N altamente conservata (S27) e dimostrano che la fosforilazione di S27 protegge il ΔFosB dalla degradazione del proteasomal. Proponiamo quindi un modello per cui la fosforilazione di ΔFosB su S27 da parte di CK2 è un meccanismo di regolazione critico del turnover di ΔFosB (Fig. 7C). Tale stabilizzazione mediata dalla fosforilazione di ΔFosB è funzionalmente importante, poiché è stato dimostrato che livelli aumentati di ΔFosB in particolari regioni cerebrali regolano direttamente numerosi geni neuronali in vivo ed esercitare potenti effetti comportamentali in modelli animali di diversi disturbi neuropsichiatrici (vedi Introduzione).
Sebbene la fosforilazione sia un modo rapido e reversibile di regolare l'attività trascrizionale di alcuni fattori di trascrizione, come CREB (proteina di legame dell'elemento di risposta del cAMP) (Bohmann, 1990), modulando la degradazione dei fattori di trascrizione si ottiene una forma di regolazione ancora più potente (meno facilmente reversibile) (Desterro et al., 2000). I fattori di trascrizione la cui attività funzionale è regolata al livello della loro degradazione includono NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999) e c-Fos (Ferrara et al., 2003), tra gli altri. In molti casi, la fosforilazione è un regolatore chiave della stabilità di un fattore di trascrizione, come è stato dimostrato per c-Fos (Okazaki e Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antigene Fos-correlato 1 (Fra-1) (Fiala e Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-giu (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) e p53 (Buschmann et al., 2001). I nostri studi aggiungono quindi ΔFosB a questa lista di fattori di trascrizione la cui attività funzionale è regolata attraverso la sua stabilità dipendente dalla fosforilazione.
CK2 è una chinasi Ser / Thr onnipresente e costitutivamente attiva che ha> 300 presunti substrati identificati finora ed è implicata in molteplici processi biologici, tra cui la morte cellulare e la sopravvivenzaLitchfield, 2003; Unger et al., 2004), risposte di stress cellulare (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003) e riparazione del DNA e rimodellamento della cromatina (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Più di un terzo dei substrati putativi di CK2 sono proteine coinvolte nella regolazione dell'espressione genica (Meggio e Pinna, 2003). In effetti, CK2 ha dimostrato di essere una chinasi nucleare prominente (Krek et al., 1992) (per la revisione, vedi Yu et al., 2001) e per interagire con i domini bZIP di diversi fattori di trascrizione (Yamaguchi et al., 1998). La fosforilazione mediata da CK2 ha anche dimostrato di modulare la degradazione (aumentandola o diminuendola) di molte proteine, tra cui IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres e Pulido, 2001), lente connessina (Yin et al., 2000), proteina HMG1 associata alla cromatina (Wisniewski et al., 1999), e diversi fattori di trascrizione come HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) e c-Myc (Channavajhala e Seldin, 2002). CK2 è più abbondante nel cervello (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), e la sua attività è stata implicata in molti aspetti della funzione cerebrale, inclusa la sopravvivenza neuronale (Boehning et al., 2003), differenziazione (Nuthall et al., 2004), funzione del canale ionico (Jones e Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) e potenziamento a lungo termine e plasticità neuronale (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman e Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Nonostante questa crescente evidenza del ruolo di CK2 nella regolazione della funzione neuronale, poco si sa su cosa controlli la sua attività. Si ritiene che CK2 sia costitutivamente attivo, con la regolazione della sua capacità di fosforilare substrati specifici basandosi principalmente su cambiamenti nella sua localizzazione intracellulare (es. Citosol vs nucleo) (Ahmed e Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Questa informazione solleva una domanda importante riguardo a quali segnali sono necessari per indurre l'accumulo di ΔFosB nel cervello dopo la stimolazione cronica (Fig. 7C). Un requisito è l'attivazione ripetuta del FosB gene e induzione di ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). I nostri dati indicano che la fosforilazione di CK2 di ΔFosB è critica per la sua stabilità, suggerendo che un secondo segnale può essere richiesto per gli effetti a lungo termine di ΔFosB sull'espressione genica, vale a dire un segnale che stimola la fosforilazione della proteina da CK2. Ciò potrebbe comportare l'attivazione di CK2 con un meccanismo sconosciuto o la sua traslocazione nel nucleo. In alternativa, la fosforilazione di CK2 di ΔFosB può essere costitutiva, in modo tale che la proteina ΔFosB viene tradotta in risposta a ciascun stimolo, una parte di essa viene fosforilata e quindi stabilizzata, cosicché con stimoli ripetuti si accumula a livelli elevati nei neuroni colpiti.
I nostri risultati mostrano che CK2 e S27 non sono probabilmente l'unico chinasi e il sito responsabile della fosforilazione di ΔFosB, perché né l'inibizione di CK2 né la mutazione S27A sono stati in grado di prevenire completamente la fosforilazione di ΔFosB. Allo stesso modo, il fatto che la mutazione S27A porti ad una riduzione di 30% nel fosfo-ΔFosB sostiene che S27 sia un importante sito di fosforilazione sulla proteina. Tuttavia, stiamo indagando su altre chinasi putative e siti di fosforilazione su ΔFosB. In definitiva, sarà importante anche analizzare la fosforilazione di S27 e di qualsiasi altro sito di fosforilazione in ΔFosB nel cervello in vivo dopo vari tipi di stimolazione cronica, ad esempio, attraverso l'uso di spettrometria di massa o anticorpi fosfospecifici.
Come accennato in precedenza, S27 in ΔFosB è altamente conservato durante l'evoluzione e tra le altre proteine della famiglia Fos. Tuttavia, il sito di consenso per CK2 non è: come mostrato in Figure 5 B, solo FosB / ΔFosB (e lo xenolog Zebrafish), ma non c-Fos o Fra-2, possiedono un residuo acido a + 3, un determinante chiave della fosforilazione di CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Pertanto, la mancanza di fosforilazione di CK2 su S27 può spiegare perché altre proteine della famiglia Fos non sono stabili come ΔFosB. Tuttavia, questo non spiega perché FosB a lunghezza intera, che ha lo stesso sito di consenso CK2 come ΔFosB, non sia stabilizzato in modo simile. Non sappiamo se FosB a tutta lunghezza è fosforilato da CK2 su questo residuo conservato. Le uniche segnalazioni di FosB (Skinner et al., 1997) e c-Fos (Okazaki e Sagata, 1995; Chen et al., 1996) la fosforilazione descrive siti nella regione C-terminale di queste proteine, che è assente in ΔFosB. La potenziale fosforilazione di FosB a lunghezza intera e di altre proteine della famiglia Fos da parte di CK2 richiede un'indagine diretta. Tuttavia, anche se fosforilati, le altre proteine della famiglia Fos sono note per contenere motivi al loro punto C che mirano alle proteine per una rapida degradazione (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Ad esempio, è stato dimostrato che un tratto di residui ~21 presenti nel C terminale di tutte le proteine della famiglia Fos, ma assente in ΔFosB, agisce come un dominio destabilizzante per c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Abbiamo scoperto che sebbene questa sequenza destabilizzi in modo simile FosB a lunghezza intera (Carle et al., 2004), l'assenza di questo dominio in ΔFosB non tiene pienamente conto della sua stabilizzazione. Piuttosto, la combinazione dell'assenza di questo dominio terminus C e della fosforilazione di Ser27 sembra rendere pienamente conto della differenza di stabilità di circa 5 volte tra ΔFosB e FosB.
Sebbene la degradazione delle proteine della famiglia Fos sia complessa e non del tutto compresa, la degradazione del proteasomal sembra essere la via principale coinvolta (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). I dati presentati qui, in cui gli inibitori del proteasomal non alterano in modo significativo il tasso di degradazione del ÀFosB, sostengono che, a differenza delle altre proteine della famiglia Fos, ΔFosB elude il proteasoma 26S, e questo gioca un ruolo centrale nella sua stabilizzazione. Proponiamo quindi uno schema per cui la maggiore stabilità di ΔFosB è attribuibile alla combinazione di due fattori principali: (1) l'assenza di un dominio destabilizzante C-terminale e (2) la fosforilazione di S27 da parte di CK2.
In sintesi, il presente studio fornisce intuizioni meccanicistiche sul perché ΔFosB, un prodotto del gene precoce immediato FosB, a differenza di tutti gli altri membri della famiglia Fos, è una proteina relativamente longeva. Sebbene si ritenga che altre proteine della famiglia Fos medino un accoppiamento transitorio di stimolo-trascrizione rapido (Morgan e Curran, 1995), la stabilità relativa di ΔFosB gli conferisce la capacità di mediare i cambiamenti trascrizionali più duraturi indotti dalla stimolazione cronica. Ciò supporta l'idea che ΔFosB funzioni come un interruttore molecolare prolungato nel cervello, convertendo gradualmente le risposte acute in adattamenti cronici. L'identificazione della fosforilazione di Ser27 come meccanismo centrale per la stabilità di ΔFosB apre nuove strade per lo sviluppo di mezzi per regolare la funzione di ΔFosB e quindi modulare i suoi effetti a lungo termine sulla plasticità neuronale e comportamentale.
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Le note
- Ricevuto novembre 21, 2005.
- Revisione ricevuta febbraio 21, 2006.
- Accettato April 2, 2006.
- Questo lavoro è stato supportato da un'Alleanza nazionale per la ricerca sulla schizofrenia e il Depression Young Investigator Award alla PGU, un National Institute on Drug Abuse (NIDA), Premio di ricerca nazionale al PGU, e sovvenzioni dall'Istituto nazionale di salute mentale e NIDA alla EJN We Ringrazia il Dr. James Bibb per il suo aiuto con il in vitro saggi di fosforilazione, Dr. Ming-Hu Han per il suo aiuto con la preparazione delle fette di cervello utilizzate per l'etichettatura metabolica, e la dottoressa Rachael Neve per il suo aiuto con la confezione degli HSV ricombinanti.
- Indirizzo attuale di G. Rudenko: Life Sciences Institute and Department of Pharmacology, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- La corrispondenza deve essere indirizzata a Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-mail: [email protected]
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- La sovraespressione striatale di {Delta} FosB riproduce movimenti involontari indotti da levodopa cronica Journal of Neuroscience, 26 maggio 2010, 30(21):7335-7343
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- Il fattore di trascrizione Activator Protein-1 nella carcinogenesi dell'epitelio respiratorio Ricerca sul cancro molecolare, 1 febbraio 2007, 5(2):109-120