COMMENTI: Sebbene sia lo stress, le droghe d'abuso e alcuni benefici naturali innescano un accumulo di DeltaFosB, lo stress attiva diverse cellule a valle e successivamente diversi recettori e geni. In altre parole, dipendenze e resistenza allo stress si basano su meccanismi fondamentalmente diversi
J Neurosci. 2010 Oct 27; 30 (43): 14585-92.
Vialou V, Labirinto I, Renthal W, LaPlant QC, Watts EL, Mouzon E, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ.
Fonte
Fishberg Department of Neuroscience, Mount Sinai School of Medicine, New York, New York 10029, USA.
Astratto
I meccanismi molecolari sottostanti gli adattamenti neuronali indotti dallo stress e dal farmaco sono compresi in modo incompleto. Una molecola implicata in tali adattamenti è ΔFosB, un fattore di trascrizione che si accumula nel nucleo del roditore accumbens (NAc), una regione chiave per la ricompensa del cervello, in risposta allo stress cronico o all'esposizione ripetuta a droghe d'abuso. Ti meccanismi di trascrizione a monte che controllano l'induzione di ΔFosB da parte di questi stimoli ambientali rimangono elusivi. Qui, identifichiamo il fattore di trascrizione dipendente dall'attività, il fattore di risposta sierica (SRF), come un nuovo mediatore a monte dello stress, ma non cocaina-, ΔFosB indotto. La SRF è downregolata in NAc di entrambi i pazienti depressi umani e nei topi cronicamente esposti a stress di sconfitta sociale. Questa downregulation di SRF è assente negli animali resilienti. Attraverso l'uso di mutagenesi inducibile, mostriamo che l'induzione mediata da stress di ΔFosB, che si verifica prevalentemente nei topi resilienti, dipende dall'espressione SRF in questa regione del cervello. Inoltre, la delezione genetica specifica di NAF di SRF promuove una varietà di fenotipi simili a prodepressant e proansia e rende gli animali più sensibili agli effetti deleteri dello stress cronico. Al contrario, dimostriamo che la SRF non ha un ruolo nell'accumulo di FOSB in NAc in risposta all'esposizione cronica alla cocaina. Inoltre, l'knock-out NAF specifico di SRF non ha alcun effetto sui comportamenti indotti dalla cocaina, indicando che lo stress cronico di sconfitta sociale e l'esposizione ripetuta alla cocaina regolano l'accumulo di ΔFosB e la sensibilità comportamentale attraverso meccanismi indipendenti.
Introduzione
Il nucleo accumbens (NAc), una regione chiave per la ricompensa del cervello, è importante per integrare input sensoriali e cognitivi che guidano comportamenti motivazionalmente rilevanti in risposta a stimoli ambientali (Nestler e Carlezon, 2006; Sesack and Grace, 2010). Il NAc è stato anche implicato in anomalie comportamentali associate alla tossicodipendenza e alla depressione. Di conseguenza, mirando al NAc con una stimolazione cerebrale profonda è stato dimostrato che allevia i comportamenti depressivi e di dipendenza sia negli umani che nei roditori (Schlaepfer et al., 2008; Vassoler et al., 2008; Heinze et al., 2009; Kuhn et al., 2009).
L'esposizione ripetuta a droghe d'abuso o stress induce modelli alterati di espressione genica in NAc, potenzialmente alla base della cronicità di dipendenza e depressione (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Maze et al., 2010; Vialou et al ., 2010). È interessante notare che il fattore di trascrizione ΔFosB, un prodotto di giunzione del gene fosB, si accumula in NAc in risposta a ripetute esposizioni a farmaci o stress (Nestler, 2008, Perrotti et al., 2008; Vialou et al., 2010). ΔFosB è stato proposto come un potenziale interruttore molecolare che guida la transizione dall'uso di droghe ricreative allo stato cronicamente dipendente (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Renthal et al., 2009), poiché il suo accumulo in NAc migliora risposte gratificanti a diverse droghe d'abuso. Più recentemente, il ruolo dell'induzione di ΔFosB in NAc a seguito di stress cronico di sconfitta sociale (Nikulina et al., 2008; Vialou et al., 2010) è stato chiarito: ΔFosB promuove risposte di coping attive a stimoli stressanti e aumenta la resilienza. Sebbene l'induzione ΔFosB avvenga in modo stimolo-dipendente, i meccanismi responsabili dell'accumulo di ΔFosB indotto da droghe e da stress in NAc rimangono sconosciuti.
Il fattore di risposta del siero (SRF) è un fattore di trascrizione necessario per l'attivazione trascrizionale dipendente dall'attività di diversi geni precoci immediati, tra cui c-fos, fosb, Egr1 e Arc (Knöll e Nordheim, 2009). Studi recenti hanno dimostrato gli effetti della SRF sulle proprietà morfologiche e citoarchitettoniche dei neuroni, inclusa la regolazione dell'attività sinaptica e la formazione di circuiti nel cervello adulto (Knöll e Nordheim, 2009). Questi risultati ci hanno spinto a indagare se la SRF è funzionalmente regolata dall'esposizione cronica a droghe d'abuso o stress, così come il potenziale impatto di tale regolamentazione sull'induzione di ΔFosB in queste condizioni.
Qui, descriviamo un nuovo meccanismo attraverso il quale la sottoregolazione della SRF in NAc promuove fenotipi prodepressivi e ansiogeni, aumentando infine la vulnerabilità di un animale agli effetti deleteri dello stress cronico. Questi effetti sono mediati, in parte, dalla perdita dell'induzione di ΔFosB in NAc di animali stressati. Le diminuzioni osservate nell'espressione di SRF e ΔFosB nel tessuto NAc post-mortem ottenuto da pazienti depressi supportano la rilevanza dei nostri risultati per la depressione umana. È interessante notare che questo meccanismo che controlla l'accumulo di ΔFosB sembra essere specifico dello stress: l'esposizione cronica alla cocaina non ha alcun effetto sull'espressione di SRF, la delezione di SRF dal NAc non ha alcun impatto sull'accumulo di ΔFosB a seguito dell'esposizione cronica alla cocaina e tale delezione di SRF non ha effetto sulla cocaina comportamenti indotti. Questa nuova interazione tra SRF e ΔFosB, nel contesto dello stress, può rappresentare un importante meccanismo omeostatico che regola la sensibilità di un individuo allo stress cronico.
Materiali e Metodi
Animali
I topi maschi C57BL / 6J di otto settimane (Jackson Laboratory) sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti comportamentali e biochimici. Tutti gli animali sono stati abituati alla struttura animale per almeno 1 settimana prima di manipolazioni sperimentali e sono stati mantenuti a 23-25 ° C su un ciclo 12 h luce / buio (luci accese da 7: 00 AM a 7: 00 PM) ad libitum accesso al cibo e all'acqua. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida della Society for Neuroscience e del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Scuola di Medicina del Monte Sinai.
Per gli esperimenti di cocaina [Western blotting e immunoprecipitazione quantitativa della cromatina (ChIP)], sono stati usati topi C8BL / 10J maschi di 57- a 6-settimana-vecchio. Gli animali hanno ricevuto sette iniezioni intraperitoneali quotidiane di salina o cocaina (20 mg / kg di cocaina-HCl; Sigma). I topi sono stati usati 24 h dopo il trattamento finale. Per esperimenti comportamentali, i topi sono stati singolarmente ospitati in post-chirurgia e sono stati trattati con 10 mg / kg (sensibilizzazione locomotoria) o 7.5 mg / kg (preferenza place condizionata) cocaina-HCl intraperitoneale, come descritto di seguito.
Srffl / flmice sono stati generati come descritto in precedenza (Ramanan et al., 2005). L'knock-out NAc specifico di Srf è stato ottenuto mediante iniezione stereotassica e successiva sovraespressione virale di Cre recombinasi (Cre) fusa a proteina fluorescente verde (GFP) utilizzando vettori di virus adeno-associato (AAV). È stato usato un Cre non cancellabile. AAV-GFP è stato iniettato al posto di AAV-Cre-GFP in Srffl / flmice come controllo. In breve, i topi sono stati anestetizzati utilizzando una miscela di ketamina (10 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), con le seguenti coordinate stereotassiche utilizzate per il parto virale: + 1.6 (anteriore / posteriore), + 1.5 (laterale), - 4.4 (dorsale / ventrale) con un angolo di 10 ° dalla linea mediana (rispetto al bregma). Un totale di 0.5 μl di virus purificato è stato somministrato bilateralmente per un periodo min 5 (0.1 μl / min), seguito da 5 min di riposo. I topi sono stati testati 2 settimane dopo l'intervento chirurgico, quando l'espressione virale era massima e i siti di iniezione virale sono stati confermati per tutti gli animali utilizzando metodi istologici standard. L'efficienza dell'espressione Cre virale-mediata è stata convalidata mediante immunoistochimica e PCR per trascrittasi inversa per Srf condotti su punzoni NAc microdisse dagli animali dati AAV-Cre-GFP e AAV-GFP nel NAc. I virus AAV-GFP e AAV-Cre-GFP sono stati generati come descritto in precedenza (Maze et al., 2010).
Procedure comportamentali
Stress sociale sconfitta.
I topi C57BL / 6J sono stati sottoposti a stress cronico di sconfitta sociale per 10 giorni consecutivi come descritto in precedenza (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). In breve, ogni topo è stato esposto a un maschio allevatore in pensione CD1 non pratico e aggressivo per 5 min al giorno. In seguito all'interazione diretta con l'aggressore CD1, gli animali sono stati quindi posti in un compartimento adiacente della stessa gabbia per il successivo 24 h con contatto sensoriale ma non fisico. Gli animali di controllo erano alloggiati in gabbie equivalenti ma con membri dello stesso ceppo. I test di interazione sociale sono stati eseguiti 24 h dopo l'ultimo giorno di sconfitta.
L'evitamento sociale di un topo maschio CD1 non familiare è stato valutato in base ai protocolli pubblicati (Berton et al., 2006; Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Il topo sperimentale è stato introdotto per la prima volta in un campo aperto contenente una gabbia di rete metallica vuota per 2.5 min. Durante una seconda sessione, un topo maschio CD1 sconosciuto è stato introdotto nella gabbia cablata. È stato misurato il tempo trascorso nella zona di interazione (un corridoio di 8 cm di larghezza che circonda la gabbia). La segregazione dei topi sconfitti in sottopopolazioni suscettibili e resilienti è stata eseguita come descritto in precedenza (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010). Poiché la maggior parte dei topi di controllo trascorreva più tempo a interagire con un obiettivo sociale che con un recinto di destinazione vuoto, un rapporto di interazione di 100 (uguale tempo trascorso nella zona di interazione in presenza rispetto all'assenza di un obiettivo sociale) è stato impostato come limite. I topi con punteggi <100 sono stati etichettati come sensibili e quelli con punteggi ≥100 sono stati etichettati come resilienti. Ampie analisi comportamentali, biochimiche ed elettrofisiologiche supportano la validità di queste distinte sottopopolazioni suscettibili e resilienti (Krishnan et al., 2007; Wilkinson et al., 2009; Vialou et al., 2010).
Per esaminare la vulnerabilità di Srffl / flmice allo stress di sconfitta sociale, i topi, iniettati bilateralmente con AAV-GFP o AAV-Cre-GFP, sono stati sottoposti a tre sconfitte consecutive nello stesso giorno e poi testati per l'interazione sociale 24 h più tardi. Questa procedura di sconfitta submaximale è stata precedentemente convalidata per rivelare fenotipi di prosuscebibilità in seguito a manipolazioni genetiche (Krishnan et al., 2007; Vialou et al., 2010).
Impotenza appresa.
Srffl / topi che sovraesprimono AAV-GFP o AAV-Cre-GFP sono stati sottoposti alla procedura di impotenza appresa descritta in precedenza (Berton et al., 2007). In breve, i topi sono stati esposti a shock intermittenti e inevitabili per 1 h per i giorni consecutivi 2 (0.45 mA, durata 5). Il giorno del test, i topi sono stati reintrodotti nella scatola per le prove di fuga consecutive 15. Durante ogni prova, è stato erogato uno shock continuo e ai topi è stata data l'opportunità di scappare entrando nel compartimento adiacente non elettrificato. Dopo una fuga riuscita, la porta si è chiusa automaticamente e la latenza di fuga è stata registrata. Quando i topi non sono fuggiti entro 25 s, il processo è stato interrotto e registrato come errore. Studi precedenti hanno dimostrato che l'espressione virale in NAc e in altre regioni non ha alcun effetto sul comportamento di fuga basale in assenza di stress (Newton et al., 2002; Berton et al., 2007).
Sensibilizzazione locomotoria.
Due settimane dopo le iniezioni intra-NAc di AAV-GFP o AAV-Cre-GFP, i topi Srffl / fl sono stati sottoposti a sensibilizzazione locomotoria. I topi sono stati abituati all'arena locomotoria per 30 minuti al giorno per 4 giorni. Dopo l'assuefazione, gli animali sono stati iniettati per via intraperitoneale con 10 mg / kg di cocaina-HCl e posti nelle scatole del locomotore. Le attività locomotorie degli animali sono state registrate utilizzando un sistema di fotocellule (San Diego Instruments) come interruzioni del fascio ambulatoriale per 30 minuti al giorno. La sensibilizzazione locomotoria è stata registrata per un periodo di 6 giorni.
Preferenza di luogo condizionata.
La procedura di condizionamento del luogo è stata condotta come descritto in precedenza (Maze et al., 2010), con le seguenti modifiche. In breve, 18 giorni dopo le infusioni intra-NAc di AAV-GFP o AAV-Cre-GFP in topi Srffl / fl, gli animali sono stati posti nelle camere di condizionamento, che consistevano in tre ambienti contestualmente distinti. I topi che mostravano una preferenza significativa per una delle due camere di condizionamento sono stati esclusi dallo studio (<10% di tutti gli animali). I gruppi di condizionamento sono stati ulteriormente bilanciati per adattarsi a qualsiasi bias della camera che poteva ancora esistere. Nei giorni successivi, gli animali sono stati iniettati con soluzione salina e confinati in una camera nel pomeriggio per 30 minuti, quindi iniettati con cocaina (7.5 mg / kg, ip) e confinati per 30 minuti nell'altra camera il giorno successivo, per un totale di due cicli di formazione in associazione per trattamento (due abbinamenti con soluzione salina e due con cocaina). Il giorno del test, i topi sono stati reinseriti nell'apparecchio senza trattamento per 20 minuti e testati per valutare la preferenza laterale. Le risposte locomotorie alla cocaina sono state valutate tramite interruzioni del raggio nelle camere accoppiate con cocaina per garantire l'efficacia del trattamento farmacologico. Per tutti i gruppi, la locomozione al basale in risposta alla soluzione salina è stata valutata per garantire che la locomozione non fosse influenzata dal trattamento virale.
Altri test comportamentali.
Srffl / flmice sono stati testati in test in aperto, luce / buio e nuoto forzato basati su protocolli pubblicati (Vialou et al., 2010). L'attività di topi in campo aperto è stata registrata per 5 min utilizzando un sistema di tracciamento video (Ethovision) in condizioni di luce rossa. Per il test luce / buio, i topi sono stati autorizzati a esplorare liberamente una scatola a due camere composta da una grande arena illuminata collegata ad un'arena chiusa più piccola. I topi sono stati testati per un periodo di 5 min per valutare la quantità di tempo trascorso in entrambi i recinti. Nei test a campo aperto e buio / buio, il tempo trascorso rispettivamente nel centro e nell'arena leggera è stato valutato come indice inverso delle risposte correlate all'ansia. Un test 1 d a nuoto forzato è stato condotto per un periodo di 5 min. L'aumento del tempo di immobilità durante il test di nuoto forzato è stato interpretato come un comportamento simile al prodipressore. Il test 1 d a nuoto forzato è stato ampiamente utilizzato nei topi ed è stato validato come misura della validità predittiva, in quanto le terapie antidepressive riducono i tempi di immobilità.
L'immunoistochimica
Srffl / flmice erano anestetizzati e perfusi intracardialmente con 4% paraformaldeide / PBS. Cervelli sono stati rimossi e crioprotetti in 30% sucrosio / PBS. Sezioni coronali (30 μm) sono state tagliate su un microtomo congelatore e processate per analisi immunoistochimiche. La convalida di Srffl / fl knock-out è stata eseguita utilizzando un anticorpo policlonale diretto contro SRF (1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology). L'espressione Cre è stata confermata tramite l'espressione GFP (policlonale policlonale, 1 / 8000, Aves Labs) nei cervelli sezionati, poiché Cre è fuso a GFP. Per quantificare l'induzione di ΔFosB dopo stress di sconfitta sociale in topi knock-out di Srffl / fl, ΔFosB è stato rilevato usando un anticorpo policlonale di coniglio sollevato contro la regione N-terminale della proteina (1 / 1000; Santa Cruz Biotechnology). Le immagini sono state scattate con un microscopio confocale (20 × ingrandimento, Zeiss). Il numero di cellule immunopositive GFP contate come negative e positive per l'immunoreattività di ΔFosB è stato quantificato in più immagini per ciascun animale, con valori medi successivamente calcolati per ciascun animale. Ogni animale era considerato un'osservazione individuale per l'analisi statistica.
Tessuto post-mortem umano
Il tessuto cerebrale umano post-mortem è stato ottenuto dalla Dallas Brain Collection, dove il tessuto viene raccolto dall'ufficio del Dallas Medical Examiner e dal programma di trapianto di tessuti del sud-ovest dell'Università del Texas (UT) in seguito al consenso del parente prossimo. Il tessuto è stato analizzato da maschi e femmine abbinati per età, intervallo post-mortem, numero di integrità dell'RNA (RIN) e pH. Fattori agonali specifici, inclusi coma, ipossia, piressia, convulsioni, disidratazione, ipoglicemia, insufficienza multiorgano e ingestione di sostanze neurotossiche al momento della morte influenzano l'integrità dell'RNA nei tessuti cerebrali post-mortem (Tomita et al., 2004). Abbiamo utilizzato una scala del fattore agonale (AFS) per caratterizzare i campioni di tessuto in ciascuna di queste otto condizioni. L'assenza di un fattore agonale è stato assegnato un punteggio di 0 e la sua presenza è stata valutata come 1 per fornire un punteggio AFS totale compreso tra 0 e 8. Il tessuto con punteggi agonali di 0 o 1 riflette campioni di buona qualità; i dati demografici del caso sono riportati nella Tabella 1. L'eccezionale qualità del tessuto è stata confermata da valori RIN elevati. I casi sono stati sottoposti a una dissezione standard prima del congelamento a scatto in isopentano a −40 ° C e della conservazione a −80 ° C; un'ulteriore dissezione di NAc è stata eseguita su tessuto congelato. Il comitato di revisione istituzionale dell'UT Southwestern ha esaminato e approvato la raccolta di questo tessuto per uso di ricerca. Un'intervista diretta a un informatore è stata eseguita per ogni caso di depressione in una data successiva, dove sono state documentate le informazioni riguardanti la malattia del caso; una diagnosi di consenso del disturbo depressivo maggiore è stata fatta utilizzando i criteri del DSM-IV da due psichiatri di ricerca. Nessuno dei casi inclusi in questo studio presentava screening tossicologici del sangue positivi per droghe d'abuso, alcol o farmaci da prescrizione diversi dagli antidepressivi. Nonostante il trattamento antidepressivo, tutti i soggetti erano clinicamente depressi al momento della morte. I campioni di tessuto sono stati dispensati in cieco per l'analisi.
Tabella 1.
Dati demografici per lo studio post mortem umano
Macchia occidentale
I campioni di NAc umano e di topo sono stati trattati come descritto in precedenza (Maze et al., 2010). Il tessuto congelato è stato sonicato in un tampone di lisi 5 mM HEPES contenente 1% SDS con proteasi (Roche) e inibitori della fosfatasi (Sigma). Le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante il test della proteina Dc (Bio-Rad). Quantità uguali di campioni di proteine sono state sottoposte a SDS-PAGE e Western blotting. Le Western blot sono state rilevate usando un anticorpo a SRF (1 / 2000; Santa Cruz Biotechnology) o GAPDH (1 / 1500; Abcam) e sono state quindi scansionate e quantificate utilizzando il sistema di imaging Odyssey (Licor).
Isolamento dell'RNA e PCR quantitativa
Isolamento dell'RNA, PCR quantitativa (qPCR) e analisi dei dati sono stati eseguiti come precedentemente descritto (Maze et al., 2010; Vialou et al., 2010). In breve, l'RNA è stato isolato con il reagente TriZol (Invitrogen) ed è stato ulteriormente purificato con i micro kit RNAeasy di Qiagen. Tutti i campioni di RNA sono stati determinati per avere valori 260 / 280 e 260 / 230 ≥1.8. La trascrizione inversa è stata eseguita usando iScript (Bio-Rad). qPCR usando SYBR green (Quanta) è stato eseguito con un sistema PCR 7900HT RT Applied Biosystems con i seguenti parametri del ciclo: 2 min a 95 ° C; Cicli 40 di 95 ° C per 15 s, 59 ° C per 30 s, 72 ° C per 33 s; e riscaldamento graduato a 95 ° C per generare curve di dissociazione per la conferma di singoli prodotti PCR. I dati sono stati analizzati confrontando i valori di C (t) della condizione di trattamento (controllo vs topi sensibili o resilienti, o controlli umani vs pazienti depressi) con il metodo ΔΔC (t) (Tsankova et al., 2006). ΔFosB primer qPCR: foward, AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT e reverse, GCCGAGGACTTGAACTTCACTCG.
Patata fritta
ChIP è stato eseguito come precedentemente descritto (Maze et al., 2010) su punzoni bilaterali NAc raggruppati da topi controllati, sensibili e resilienti (quattro punzoni / mouse 14-gauge) 1 h dopo l'ultima esperienza di sconfitta e da salina e cocaina- animali trattati 24 h dopo il trattamento finale. Il tessuto era reticolato in 1% formaldeide. La fissazione è stata successivamente interrotta mediante applicazione di glicina e il tessuto è stato lavato e mantenuto a -80 ° C fino al momento dell'uso. La cromatina tranciata è stata incubata per una notte con un anticorpo anti-SRF (Santa Cruz Biotechnology) precedentemente legato a sfere magnetiche (Dynabeads M-280; Invitrogen). Dopo reticolazione inversa e purificazione del DNA, il legame di SRF al promotore di fosb è stato determinato mediante qPCR utilizzando primer che coprono una regione del promotore di fosb contenente due siti di legame degli elementi di risposta del siero. I pulldown SRF sono stati notevolmente arricchiti rispetto ai controlli senza anticorpi. Primer promotore del gene fosf del mouse: avanti, CCCTCTGACGTAATTGCTAGG e reverse, ACCTCCCAAACTCTCCCTTC.
analisi statistiche
ANOVA unidirezionali sono stati utilizzati per confrontare le medie tra topi di controllo, suscettibili e resilienti nelle analisi biochimiche e comportamentali. Sono stati utilizzati ANOVA a due vie per confrontare l'induzione di ΔFosB per sconfitta sociale nei topi knock-out locali Srf, nonché per confrontare l'effetto del knock-out Srf nei protocolli appresi di impotenza e sensibilizzazione locomotoria. I test t di Student sono stati utilizzati per confrontare le medie nell'effetto del knock-out di Srf sull'induzione di ΔFosB e tra i gruppi nel tessuto post-mortem umano e l'analisi ChIP del topo. Le differenze tra le condizioni sperimentali sono state considerate statisticamente significative quando p ≤ 0.05.
Risultati
Espressione SRF e ΔFosB nella depressione umana e nei topi socialmente sconfitti
Per esplorare un potenziale ruolo della SRF nello sviluppo di comportamenti di tipo depressivo, abbiamo prima valutato l'espressione della proteina SRF in NAc di pazienti umani con depressione post-mortem. I soggetti depressi hanno mostrato livelli di SRF significativamente ridotti in NAc rispetto ai controlli di pari età (t (19) = 1.9; p <0.05) (Fig. 1A). Dato il ruolo della SRF nella regolazione dell'espressione genica precoce immediata dipendente dall'attività (Ramanan et al., 2005), abbiamo ipotizzato che SRF possa essere coinvolta nel controllo dell'espressione di ΔFosB in questa regione del cervello. A sostegno di questa ipotesi, abbiamo osservato che i livelli di mRNA di Δfosb erano anche significativamente ridotti in NAc di esseri umani depressi (t (16) = 1.8; p <0.05) (Fig. 1B). Ciò è coerente con i recenti risultati di una diminuzione dei livelli di proteina ΔFosB anche in queste condizioni (Vialou et al., 2010).
Immagine 1.
La repressione della SRF indotta dallo stress cronico è correlata alla ridotta trascrizione di ΔFosB in NAc. A, B, i pazienti umani depressi post mortem mostrano livelli ridotti di proteina SRF (n = 10 / gruppo; A) ed espressione di mRNA Δfosb in NAc (n = 8 / gruppo; B). C, I topi sottoposti a stress da sconfitta sociale cronica (10 d) sono stati raggruppati in sottopopolazioni suscettibili e resilienti. D, Lo stress da sconfitta sociale cronica riduce i livelli di proteina SRF in NAc di topi suscettibili, ma non resilienti, rispetto ai controlli 24 ore dopo il test di interazione sociale mostrato in C.E, i livelli di mRNA di ΔfosB in NAc sono inalterati nei topi sensibili, ma in modo significativo sovraregolati negli animali resilienti (n = 7-15 / gruppo). La proteina F, SRF mostra un aumento del legame al promotore del gene fosb dopo stress da sconfitta sociale cronica solo nei topi resilienti e non suscettibili (n = 5 / gruppo). I dati visualizzati sono espressi come media ± SEM (rappresentati come barre di errore). Con., Controllo; Dep., Depresso; Sus., Suscettibile; Res., Resiliente. * p <0.05 rispetto al controllo; *** p <0.001 rispetto al controllo; #p <0.05 rispetto a suscettibile; ## p <0.01 rispetto a suscettibile; ### p <0.001 rispetto a suscettibile.
Per estendere questi risultati, abbiamo utilizzato il protocollo dello stress da sconfitta sociale cronica nei topi. Due gruppi distinguibili di topi sconfitti, suscettibili e resilienti, erano evidenti (Krishnan et al., 2007) sulla base di una misura di evitamento sociale, in cui gli animali suscettibili mostravano un'interazione sociale significativamente ridotta rispetto sia agli animali di controllo che a quelli resilienti (F (2,23, 157.2) = 0.001; p <0.001; test t con una correzione di Bonferroni, suscettibile vs controllo, p <0.05; resiliente vs controllo, p <0.01; resiliente vs suscettibile, p <1) (Fig. 2,32C). Due giorni dopo l'ultimo episodio di sconfitta, i topi di controllo suscettibili, resilienti e non sconfitti sono stati analizzati per l'espressione di SRF in NAc. Analogamente ai risultati nella depressione umana, i livelli di proteina SRF erano significativamente ridotti in NAc di topi sensibili rispetto ai controlli, mentre i livelli di SRF non erano influenzati in NAc di topi resilienti (F (4.7) = 0.05; p <0.05; t test con a Correzione di Bonferroni, suscettibile vs controllo, p <0.05; resiliente vs suscettibile, p <1) (Fig. XNUMXD).
Successivamente, abbiamo esaminato l'espressione dell'mRNA di Δfosb in NAc di questi tre gruppi di animali e osservato un aumento significativo nell'espressione di Δfosb solo negli animali resilienti, con una tendenza ma nessun aumento significativo osservato nei topi sensibili (t (14) = 2.1; p <0.05 ) (Fig. 1E). Per indagare ulteriormente le possibili interazioni tra i livelli di SRF e la trascrizione di Δfosb, abbiamo utilizzato ChIP per esaminare se il legame di SRF al promotore del gene fosb fosse alterato dopo stress da sconfitta sociale cronica in coorti separate di topi suscettibili e resilienti. Gli animali resilienti hanno mostrato un legame SRF significativamente migliorato al promotore di fosb in NAc rispetto ai controlli (t (8) = 2.1; p <0.05) e rispetto ai topi sensibili (t (8) = 2.0; p <0.05). Nessuna differenza è stata osservata tra i controlli e i topi sensibili, probabilmente riflettendo la mancanza di induzione di SRF nei topi sensibili (Fig. 1F).
Per confermare il ruolo della SRF nella regolazione di ΔFosB a seguito di stress da sconfitta sociale cronica, sono stati utilizzati topi Srffl / fl per esaminare l'effetto di una delezione selettiva di SRF dal NAc sull'induzione dello stress di ΔFosB. I topi Srffl / fl sono stati iniettati stereotassicamente intra-NAc con vettori AAV che esprimono GFP o Cre-GFP. Un knock-out specifico per NAc di SRF indotto da AAV-Cre-GFP è stato confermato immunoistochimicamente (Fig. 2A). In effetti, non vi era alcuna sovrapposizione tra la colorazione SRF e l'espressione di Cre, a dimostrazione dell'efficacia del knock-out. Nei punch NAc microdissezionati, abbiamo rilevato una significativa diminuzione del 50% dei livelli di proteina SRF (t (11) = 4.3; p <0.001). L'entità probabilmente riflette il fatto che una frazione di tessuto in tali microdissezioni non è infetta viralmente.
Immagine 2.
SRF media l'induzione di ΔFosB da stress da sconfitta sociale cronica. A, l'iniezione di AAV-Cre-GFP nel NAc dei topi Srffl / fl provoca il knock-out della proteina SRF nei neuroni che esprimono Cre. L'iniezione di AAV-GFP è stata senza effetto distinguibile. B, Tale knock-out selettivo di SRF da NAc blocca completamente l'induzione di ΔFosB in NAc a seguito di stress da sconfitta sociale cronica (n = 4 / gruppo). I dati visualizzati sono espressi come media ± SEM (rappresentati come barre di errore). * p <0.05 rispetto al controllo AAV-GFP; ** p <0.01 rispetto alla sconfitta AAV-GFP.
Successivamente abbiamo eseguito immunoistochimica quantitativa per ΔFosB in NAc di topi Srffl / fl sconfitti iniettati intra-NAc con AAV-Cre-GFP o AAV-GFP. A seguito di stress da sconfitta sociale cronica, l'espressione di ΔFosB è stata indotta in modo significativo in NAc di animali iniettati con AAV-GFP (interazione virus × trattamento, F (1,12) = 6.4; test t con correzione Bonferroni, controllo vs sconfitta, p <0.05; AAV-Cre vs AAV-GFP, p <0.01). Tuttavia, questa induzione non è stata osservata nei topi Srffl / fl che ricevevano AAV-Cre-GFP (Fig. 2B), dimostrando che l'induzione di ΔFosB in NAc da stress cronico richiede SRF.
Il knock-out della SRF in NAc promuove fenotipi simili alla prodepression e alla ansia
Poiché è stato precedentemente dimostrato che l'induzione di ΔFosB da stress da sconfitta sociale cronica media la resilienza (Vialou et al., 2010), abbiamo ipotizzato che la sottoregolazione di SRF e la conseguente perdita di induzione di ΔFosB, negli animali suscettibili, possa rappresentare un adattamento negativo che alla fine rende animali più vulnerabili agli effetti deleteri dello stress. Per testare questa ipotesi, abbiamo indotto una delezione locale NAc-specifica del gene Srf in topi adulti Srffl / fl come descritto sopra, e i topi risultanti ei loro controlli sono stati testati in una batteria di paradigmi comportamentali per valutare la depressione e l'ansia di base. come il comportamento. La delezione NAc locale di SRF ha promosso un effetto simile alla prodepressione misurato tramite il test di nuoto forzato (t (30) = 2.5; p <0.05), così come un effetto ansiogeno misurato in campo aperto (t (38) = 1.9; p <0.05) e test luce / buio (t (8) = 1.9; p <0.05). Pertanto, i topi Srffl / fl che hanno ricevuto AAV-Cre-GFP nel NAc hanno mostrato una diminuzione della latenza all'immobilità nel test di nuoto forzato, meno tempo al centro di un campo aperto e meno tempo nel compartimento luminoso di una scatola chiara / scura rispetto agli animali iniettati con AAV-GFP (Fig. 3A-C). Tuttavia, la delezione intra-NAc della SRF non ha alterato i livelli basali di locomozione, suggerendo che gli effetti comportamentali osservati negli animali knock-out della SRF non erano dovuti ad anomalie nell'attività locomotoria generale (Fig. 3D). Questi dati sono interessanti alla luce di precedenti rapporti che suggeriscono che, sebbene ΔFosB in NAc regoli comportamenti di tipo depressivo, non sembra essere coinvolto nelle risposte legate all'ansia (Vialou et al., 2010). I nostri risultati attuali che la perdita di SRF induce risposte ansiogene suggeriscono che lo fa attraverso obiettivi diversi da ΔFosB.
Immagine 3.
Il knock-out della SRF dal NAc promuove fenotipi simili a prodepressione e proansia. AC, knock-out selettivo di SRF dal NAc, ottenuto tramite iniezione AAV-Cre-GFP nel NAc di topi Srffl / fl, riduce la latenza all'immobilità nel test di nuoto forzato (n = 14-18 / gruppo; A) e riduce il tempo trascorso al centro e il tempo trascorso nel compartimento luminoso nei test in campo aperto (B) e luce / buio (C), rispettivamente (n = 5-15 / gruppo). D, Nessuna differenza nell'attività locomotoria basale è stata osservata nel campo aperto dei topi che hanno ricevuto iniezioni intra-NAc di AAV-GFP o AAV-Cre-GFP. E, F, Maggiore suscettibilità all'impotenza appresa (n = 7-8 / gruppo; E) e stress da sconfitta sociale (n = 5-6 / gruppo; F), misurata, rispettivamente, dalla latenza di fuga e dal tempo di interazione sociale . I dati visualizzati sono espressi come media ± SEM (rappresentati come barre di errore). * p <0.05 rispetto al GFP o rispetto al target assente; ** p <0.01 rispetto a GFP; *** p <0.001 rispetto a GFP.
Successivamente abbiamo studiato se la delezione di SRF in NAc aumenta anche la vulnerabilità di un animale agli effetti dannosi dello stress ripetuto. I topi Srffl / fl, iniettati con AAV-Cre-GFP o AAV-GFP nel NAc, sono stati esaminati in due modelli di depressione, impotenza appresa e stress da sconfitta sociale cronica. Nell'impotenza appresa, gli animali Srffl / fl che ricevevano AAV-Cre-GFP mostravano una maggiore latenza per sfuggire a uno shock del piede a seguito di una precedente esposizione a stress da shock inevitabile (trattamento × interazione sperimentale, F (14,180) = 10.2; test t con una correzione Bonferroni, p <0.001; AAV-Cre vs AAV-GFP, p <0.01), indicando una maggiore suscettibilità ai deficit comportamentali indotti dallo stress (Fig. 3E). Allo stesso modo, la delezione locale di SRF da NAc ha anche aumentato l'avversione sociale (t (10) = 1.8; p <0.05) rispetto agli animali di controllo iniettati con AAV-GFP a seguito di stress da sconfitta sociale cronica (Fig. 3F), un effetto simile alla prodepressione.
Mancanza di coinvolgimento della SRF nell'induzione del FOSB e nelle risposte comportamentali alla cocaina
Dato che ΔFosB è anche indotto in NAc in risposta a droghe d'abuso come la cocaina, era interessante esaminare un potenziale ruolo della SRF nell'azione della cocaina. A differenza dello stress da sconfitta sociale cronica, l'esposizione ripetuta alla cocaina non ha alterato l'espressione della proteina SRF in NAc (t (14) = 0.8; p> 0.05) (Fig. 4A) e non ha avuto alcun effetto sul legame della SRF al promotore del gene fosB in questa regione del cervello (t (4) = 0.7; p> 0.05) (Fig. 4B). Ciò suggerisce che, contrariamente allo stress, l'induzione di ΔFosB dopo la cocaina cronica non è mediata dalla SRF. Lo abbiamo testato direttamente esaminando se l'accumulo di ΔFosB dopo la cocaina cronica è alterato negli animali Srffl / fl che ricevono AAV-Cre-GFP rispetto a AAV-GFP in NAc. Abbiamo scoperto che la delezione di SRF non ha avuto alcun effetto sull'accumulo di ΔFosB indotto dalla cocaina in questa regione del cervello (Fig. 4C).
Immagine 4.
La perdita di SRF non ha avuto alcun effetto sull'induzione della cocaina di ΔFosB o dei comportamenti regolati dalla cocaina. A, B, esposizione ripetuta alla cocaina (7 d, 20 mg / kg cocaina-HCl) non ha avuto alcun effetto sull'espressione della proteina SRF in NAc (A) o sul legame SRF al promotore del gene fosB in questa regione del cervello (B) 24 h dopo esposizione al farmaco (n = 5 / gruppo). L'accumulo di C, ΔFosB, misurato immunocitochimicamente, a seguito dell'esposizione cronica alla cocaina non è influenzato dal knock-out NAc specifico di SRF. D, E, la delezione locale di SRF da NAc non ha avuto alcun effetto sull'attività locomotoria a seguito di un'iniezione di soluzione salina (d 1) sull'attività locomotoria e sensibilizzazione indotta da cocaina (n = 8 / gruppo) (d 1-7; D) o su preferenza di posto condizionata cocaina (n = 8 / gruppo; E). I dati visualizzati sono espressi come media ± SEM (rappresentati come barre di errore).
Per dare seguito a questa scoperta sorprendente, abbiamo studiato se un knock-out selettivo della SRF da NAc altera le risposte comportamentali alla cocaina. Coerentemente con la mancanza di regolazione da parte della SRF dell'induzione di ΔFosB da parte della cocaina, il knock-out specifico per NAc di SRF non ha avuto alcun effetto sull'attività locomotoria indotta da cocaina acuta o sensibilizzazione locomotoria osservata dopo esposizioni ripetute di cocaina (trattamento × interazione tempo, F (4,80) = 0.3; p> 0.05) (Fig. 4D). Allo stesso modo, il knock-out specifico per NAc della SRF non ha avuto effetto sulla preferenza di posto condizionata dalla cocaina (t (14) = 0.1; p> 0.05) (Fig. 4E), che fornisce una misura indiretta della ricompensa per la cocaina.
Discussione
Questo studio ha identificato SRF come un nuovo mediatore a monte di ΔFosB in NAc dopo uno stress cronico di sconfitta sociale e implica SRF nello sviluppo di comportamenti depressivi e ansiosi. Forniamo prove dirette che lo stress cronico di sconfitta sociale diminuisce i livelli di SRF in NAc di animali suscettibili, ma non resilienti, e che questa downregulation impedisce l'induzione di ΔFosB in questa regione del cervello, che abbiamo dimostrato necessaria per affrontare efficacemente lo stress cronico, cioè, resilienza (Vialou et al., 2010). Una riduzione simile nell'espressione di SRF è stata trovata in NAc di umani depressi, dove anche l'espressione di mRNA e di proteina di ÀFosB è stata ridotta. Al contrario, i livelli di ΔFosB non erano ridotti nel NAc dei topi sensibili, nonostante una downregulation di SRF, che implicasse altri meccanismi trascrizionali, ancora sconosciuti, nel controllo dell'espressione di ÀFosB. Un ruolo causale per SRF nella mediazione dell'induzione di ΔFosB in NAc dopo stress cronico è stato stabilito mediante l'uso di una cancellazione genetica inducibile di SRF da questa regione del cervello. L'analisi comportamentale dei topi con questo knock-out SRF specifico per NAc impone inoltre all'SRF di svolgere un ruolo chiave nello sviluppo sia di comportamenti depressivi sia di ansia. In netto contrasto, la delezione di SRF non ha avuto alcun effetto sull'induzione di ΔFosB in risposta alla somministrazione cronica di cocaina o sugli effetti comportamentali della cocaina. Questi risultati supportano un nuovo ruolo specifico dello stimolo per SRF nella regolazione dell'induzione di ΔFosB e delle risposte comportamentali a distorsioni ambientali distinte.
In precedenza la trascrizione mediata da SRF rispondeva all'attività sinaptica, in gran parte innescata dall'aumento dell'afflusso di calcio, oltre che all'aumento dell'attività neurotrofica, in particolare nel caso del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) (Bading et al., 1993; Xia et al., 1996; Johnson et al., 1997; Chang et al., 2004; Kalita et al., 2006; Knöll e Nordheim, 2009). Ciò solleva la questione interessante del perché la SRF sia sottoregolata in NAc di topi suscettibili, ma non resilienti, dopo stress cronico di sconfitta sociale. Questa regolazione differenziale probabilmente non è mediata dalla segnalazione di dopamina o BDNF, poiché i topi suscettibili mostrano un aumento dei livelli di proteina BDNF e un aumento della segnalazione BDNF a valle in NAc così come un potenziamento del lancio di neuroni della dopamina con area tegmentale ventrale (VTA), che innervano il NAc, gli animali resilienti mostrano livelli normali di segnalazione BDNF e velocità di infornamento VTA (Krishnan et al., 2007). Una possibilità alternativa è che l'espressione di SRF sia soppressa in NAc in risposta a un'alterazione glutamatergica alterata di questa regione del cervello, che abbiamo dimostrato è regolata in modo differenziale nei topi sensibili e resilienti (Vialou et al., 2010). Sono necessari ulteriori studi per studiare direttamente questo e altri possibili meccanismi.
Recenti studi con l'uso di genome-wide e altri metodi suggeriscono che ~5-10% dei geni target SRF nei neuroni sono i primi geni immediati (Philippar et al., 2004; Ramanan et al., 2005; Etkin et al., 2006; Knöll e Nordheim, 2009). Ciò è coerente con i nostri dati che dimostrano un ruolo fondamentale per SRF nell'induzione di ΔFosB, un prodotto troncato del gene immediato immediato di fosb, da stress cronico. È interessante notare che numerosi geni bersaglio SRF identificati in questi vari studi rappresentano anche bersagli noti di ΔFosB in NAc (Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008, 2009; Maze et al., 2010). Tra questi geni comunemente regolati ce ne sono diversi che sono noti per regolare il citoscheletro neuronale (ad esempio, Cdk5, Arc e Actb). Questo, a sua volta, è coerente con i rapporti secondo cui l'SRF influenza la dinamica dell'atino e la motilità neuronale in diversi tipi di cellule neuronali (Alberti et al., 2005; Ramanan et al., 2005; Knöll et al., 2006), mentre ΔFosB è noto a influenzare la crescita delle spine dendritiche dei neuroni di NAc (Maze et al., 2010). Tali endpoint funzionali comuni possono riflettere gli effetti concertati di SRF, combinati con la sua induzione di ΔFosB, agendo su una serie di geni bersaglio comuni per influenzare la morfologia neuronale e, in definitiva, il comportamento complesso.
È stato anche dimostrato che la SRF svolge ruoli critici nella regolazione della plasticità sinaptica e dell'espressione e del comportamento del gene dipendente dall'attività neuronale. Ad esempio, la perdita dell'induzione dipendente da SRF dei geni precoci immediati in risposta all'esplorazione volontaria di un nuovo ambiente o attivazione neuronale da convulsioni elettroconvulsive è stata associata ad alterazione del potenziamento sinaptico a lungo termine nell'ippocampo dei mutanti di Srf (Ramanan et al. , 2005; Etkin et al., 2006). Inoltre, la deplezione della SRF nell'ippocampo ha dimostrato di causare deficit nella depressione sinaptica a lungo termine, espressione genica precoce immediata indotta da un nuovo contesto e alterata abitudine durante l'esplorazione di un nuovo ambiente (Etkin et al., 2006). Questi dati stabiliscono l'importanza dell'SRF nella capacità di un animale di adattarsi adeguatamente alle perturbazioni ambientali, come nel caso di cui sopra di imparare ad abituarsi a un nuovo ambiente, o, nel caso di adattamento a stimoli stressanti negativi, per prevenire la promulgazione di stress -deficit comportamentali indotti, come nel nostro presente studio. Pertanto, osserviamo che gli animali che mostrano deficit nell'espressione della SRF, sia in risposta allo stress da sconfitta sociale in individui suscettibili o attraverso l'arresto diretto della SRF, mostrano un aumento dei comportamenti depressivi e ansiosi. Dato che i soggetti umani depressi presentano anche livelli di SRF ridotti nel NAc, è ipotizzabile che SRF svolga un ruolo fondamentale nella regolazione della capacità di un individuo di adattarsi positivamente a stimoli ambientali negativi, in parte attraverso la regolazione dell'espressione di ΔFosB nel NAc.
MECCANISMI DIFFERENTI: ADDICTION VS RESISTANCE DELLO STRESS
Una scoperta sorprendente del presente studio è che, sebbene SRF sia richiesto per l'accumulo di ÀFosB in NAc in risposta allo stress cronico, non è richiesto per l'induzione di ÀFosB all'interno della stessa regione del cervello in risposta alla cocaina cronica. Allo stesso modo, SRF non è richiesto per le normali risposte comportamentali al farmaco. Questi dati mostrano che, nonostante il fatto che ΔFosB sia indotto in NAc in risposta a molti tipi di stimoli (Nestler et al., 1999; Nestler, 2008), sembrano esserci percorsi molecolari distinti che portano all'induzione di ΔFosB. Una possibile spiegazione di questi risultati è rappresentata dai tipi cellulari parzialmente diversi che mostrano l'accumulo di ΔFosB in risposta allo stress rispetto alla cocaina. Lo stress cronico induce ΔFosB all'incirca allo stesso modo all'interno delle due principali sottopopolazioni di neuroni medi spinosi NAc, quelli che esprimono prevalentemente D1 rispetto ai recettori della dopamina D2, mentre la cocaina induce ΔFosB prevalentemente nei neuroni D1 + (Kelz et al., 1999; Perrotti et al., 2004) . Pertanto, è possibile che i pathways SRF-dipendenti possano essere importanti per l'induzione di ΔFosB nei neuroni D2 +. Tuttavia, ciò non spiegherebbe la perdita completa dell'induzione di ΔFosB nei topi knock-out SRF dopo stress cronico, poiché l'induzione si verifica in entrambi i sottotipi neuronali. Una spiegazione alternativa è che lo stress cronico e la cocaina cronica interferiscono su distinte cascate di segnalazione intracellulare, in virtù delle loro distinte modalità di azione sui neuroni NAc, con stress cronico che può funzionare attraverso alterata trasmissione glutammatergica, come notato in precedenza, e cocaina cronica che funziona principalmente attraverso D1 segnalazione dei recettori (Nestler, 2008). Ancora un'altra possibilità è che l'induzione di ΔFosB da stress cronico versus cocaina cronica dipende da distinti meccanismi trascrizionali che sono differenzialmente controllati da distinti input neurali innervando il NAc da varie regioni di proiezione glutammatergico, ad esempio, diverse regioni di corteccia prefrontale, ippocampo e amigdala. È necessario un ulteriore lavoro per esplorare queste e alternative possibilità.
Insieme, i nostri risultati identificano un nuovo meccanismo trascrizionale attraverso il quale ΔFosB è indotto in NAc per mediare le risposte di proresilienza agli stimoli stressanti. Questo studio fornisce anche nuove importanti informazioni sul ruolo svolto da SRF a livello di NAc nella regolazione dei comportamenti di depressione e ansia. Acquisire una migliore comprensione del ruolo trascrizionale della SRF nella regolazione di tali comportamenti aiuterà nell'identificazione di nuovi geni target coinvolti nella resilienza ai disturbi legati allo stress e potrebbe facilitare lo sviluppo futuro di terapie antidepressive più efficaci.
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dall'Istituto nazionale di salute mentale e dall'Istituto nazionale per l'abuso di droghe e da un'alleanza di ricerca con AstraZeneca. Ringraziamo David D. Ginty per aver fornito Srffl / fl mice.
La corrispondenza deve essere indirizzata a Eric J. Nestler, Dipartimento di Neuroscienze di Fishberg, Scuola di Medicina del Monte Sinai, Uno Gustave L. Levy Place, Box 1065, New York, NY 10029-6574. [email protected]
Copyright © 2010 gli autori 0270-6474 / 10 / 3014585-08 $ 15.00 / 0
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