Drogopplevelse epigenetisk primer Fosb-geninducerbarhet i rottekjernen accumbens (2012)

Abstrakt

Introduksjon

Rusavhengighet er preget av tvangsmessig søk og bruk av rusmidler til tross for alvorlige negative konsekvenser ( Kalivas et al., 2005 ; Hyman et al., 2006 ). Kronisk rusmiddeleksponering forårsaker vedvarende endringer i genuttrykk i ventral striatum (eller nucleus accumbens; NAc) og dorsal striatum (eller caudate putamen; CPu), striatale strukturer involvert i rusmiddelbelønning og -avhengighet ( Freeman et al., 2001 ; Robinson og Kolb, 2004 ; Shaham og Hope, 2005 ; Maze og Nestler, 2011 ). ΔFosB, et avkortet og stabilt protein kodet av immediate-early-genet, Fosb , er en godt karakterisert transkripsjonsfaktor indusert i NAc og CPu ved kronisk eksponering for praktisk talt alle rusmidler, hvor den medierer sensibiliserte atferdsresponser på gjentatt rusmiddeladministrasjon ( Nestler, 2008 ). Hvorvidt tidligere kronisk eksponering for et rusmiddel endrer påfølgende induksjon av ΔFosB, er imidlertid fortsatt ukjent.

Vi antok nylig at kromatinmodifikasjoner som respons på kronisk medikamenteksponering kan endre induserbarheten til spesifikke gener i målhjerneområder ( Robison og Nestler, 2011 ). Økende bevis har vist at misbruk av rusmidler etter kronisk administrering endrer strukturen og transkripsjonell tilgjengelighet av kromatin gjennom en rekke typer modifikasjoner, inkludert fosforylering, acetylering og metylering av histonhaler. Nyere arbeid innen cellekultursystemer har fokusert på rekruttering av RNA-polymerase II (Pol II) til promoteren av "induserbare" gener før de uttrykkes, med Pol II bundet persistent til proksimale promotorregioner og rundt transkripsjonsstartstedet (TSS) i en "stoppet" tilstand ( Core og Lis, 2008 ; Nechaev og Adelman, 2008 ). Aktivering av den stoppede Pol II antas deretter å være ansvarlig for at den unnslipper fra promoter- og TSS-regioner og transkripsjonen av disse "primede" genene ( Zeitlinger et al., 2007 ; Saha et al., 2011 ; Bataille et al., 2012 ).

Her viser vi at tidligere kronisk eksponering for kokain, etterfulgt av en forlenget abstinensperiode, endrer induserbarheten til Fosb -genet for påfølgende kokainadministrasjon, der NAc er primet for induksjon mens CPu ikke er det. Vi identifiserer deretter distinkte kromatinsignaturer ved Fosb -genpromotoren i NAc og CPu som er assosiert med slik avvikende induserbarhet av Fosb -genet, inkludert rekruttering av stoppet Pol II ved den proksimale Fosb- promotoren i NAc, samt endringer i flere aktiverende eller repressive histonmodifikasjoner i begge hjerneregioner. Disse resultatene gir ny innsikt i kromatindynamikken ved Fosb -genpromotoren og indikerer for første gang en mekanisme der stopping av Pol II forbereder Fosb for større aktivering i NAc ved re-eksponering for kokain.

Materialer og metoder

Resultater

Større Fosb-induksjonsevne i NAc, men ikke CPu, av kokain-erfarne rotter

For å undersøke påvirkningen av en tidligere kronisk kokainkur, etterfulgt av en lengre periode med abstinenser, på induserbarheten av Fosb -genet som respons på en påfølgende kokainutfordring, fikk rotter som tidligere hadde blitt injisert ip to ganger daglig med saltvann eller kokain (15 mg/kg) i 10 dager utfordringsdoser av legemidlet etter 28 dager med abstinens ( fig. 1A ). Vi målte først lokomotoriske responser i én gruppe dyr for å bekrefte induksjon av lokomotorisk sensibilisering ved tidligere kokaineksponering, en forventet varig konsekvens av legemiddeladministrasjon. Kokainerfarne og -naive rotter viste tilsvarende baseline lokomotorisk aktivitet, der en kokainutfordring til rusmiddelnaive dyr økte bevegelsen deres ( fig. 1B . Gjentatte målinger toveis ANOVA, behandling: F _1,66 = 30.42, p <0.0001; kokainutfordring: F _2,66 = 58.39, p <0.0001; behandling x kokainutfordring: F _2,66 = 8.56, p = 0.0005, Bonferroni-posttester ^{^} p <0.001). Denne kokainutfordringen induserte signifikant større lokomotorisk aktivitet, dvs. sensibilisering, hos kokainerfarne rotter (Bonferroni-posttester *p <0.001).

  

Figur 1

Effekt av tidligere kronisk kokaineksponering på lokomotorisk aktivitet og Fosb induksjon i NAc og CPu ved re-eksponering for stoffet

For å evaluere effektene av dette kokain-forbehandlingsregimet på ΔFosB-uttrykk i NAc og CPu, måler vi ΔFosB-protein med immunohistokemiske metoder 24 timer etter at kokain-naive og kokainerfarne dyr ble behandlet med 0, 1, 3 eller 6 daglig kokainutfordring injeksjoner (15 mg / kg; se Fig 1A). Som tidligere etablert (Nye et al., 1995), Var 3 kokain injeksjoner tilstrekkelig til å indusere ΔFosB protein i NAc og CPu av narkotika-naive dyr, og akkumuleringen forblir signifikant etter 6 dager med kokaininjeksjoner (Fig. 1C. Gjentatte målinger toveis ANOVA, NAc-kjerne, behandling: F_1,28= 23.5, p <0.0001; kokainutfordring: F_3,28= 49.16, p <0.0001; behandling x kokainutfordring: F_3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc skall, behandling: F_1,28= 18.69, p <0.0001; kokainutfordring: F_3,28= 31.52, p <0.0001; behandling x kokainutfordring: F_3,28= 3.21, p <0.05; CPu, behandling: F_1,28= 9.47, p <0.001; kokainutfordring: F_3,28= 19.74, p <0.0001; behandling x kokainutfordring: F_3,28= 0.94, p> 0.05. I NAc-kjerne, skall og CPu, Bonferroni posttester ^{^}p <0.05). Hos kokainerfarne dyr var det ingen bevis for vedvarende ΔFosB-induksjon i NAc eller CPu etter 28 dagers tilbaketrekning, i samsvar med tidligere rapporter om at ΔFosB-signalet forsvinner fullt ut på dette tidspunktet (Nye et al., 1995), årsaken til dette tidspunktet ble brukt i denne studien. Påfallende viste imidlertid at kokain-erfarne rotter som fikk 3- eller 6-kokain-injeksjoner, viste signifikant større ΔFosB-proteininduksjon i NAc, en effekt som var tydelig i både kjerne- og shell-subregioner (Fig. 1C. Bonferroni posttester * p <0.05). I motsetning til dette ble ingen slik større induksjon av ΔFosB-protein observert i CPu; i stedet ble ekvivalent ΔFosB-induksjon sett i denne regionen etter 3 eller 6 dager med kokainutfordringsinjeksjoner i kokainnaive og -erfarne rotter (Fig. 1C).

For å få innsikt i de transkripsjonelle endringene som oppstår i NAc og CPu som respons på en kokainutfordring, studerte vi tidsforløpet (45, 90 og 180 min) for induserbarheten av ΔFosB- og FosB mRNA-transkripter ved en enkelt kokain- eller saltvannsinjeksjon gitt til kokain-naive og -erfarne rotter etter 28 dager med abstinens (se figur 1A ). Sammenlignet med en saltvannsutfordring induserte en kokainutfordring en rask økning i ΔFosB- og FosB mRNA-nivåer på alle tre tidspunkter i både NAc og CPu hos kokain-naive dyr ( figur 1D . Gjentatte målinger enveis ANOVA per tidspunkt; Bonferroni-posttester ^{^} p <0.05). I NAc observerte vi større ΔFosB- og FosB mRNA-induksjon hos kokainerfarne dyr sammenlignet med kokain-naive dyr etter kokainutfordringen. Effekten var signifikant etter 90 minutter, mens derimot induserbarheten av ΔFosB- og FosB mRNA i CPu var signifikant redusert hos kokainerfarne dyr ( fig. 1D . Bonferroni-posttester ^% p=0.08, *p<0.05).

Karakterisering av oppstrøms signalveier i NAc og CPu av kokain-erfarne rotter

En mulig forklaring på den endrede induserbarheten til Fosb -genet i NAc og CPu etter en tidligere kronisk kokainkur er at en fjern historie med kokaineksponering kan indusere varige endringer i signalveier som er oppstrøms for Fosb -geninduksjon, slik at en kokainutfordring deretter induserer genet i en avvikende grad. For å studere denne hypotesen analyserte vi de to transkripsjonsfaktorene, SRF og CREB, som nylig har vist seg å være nødvendige for kokaininduksjon av ΔFosB i disse hjerneområdene ( Vialou et al., 2012 ), sammen med oppstrøms proteinkinaser, ERK og AKT, som også er involvert i kokainvirkning ( Valjent et al., 2000 ; Lu et al., 2006 ; Boudreau et al., 2009 ). Vi klarte ikke å oppdage noen endringer i totale eller fosforylerte nivåer av disse forskjellige proteinene som kunne forklare den endrede induserbarheten til Fosb som ble observert, inkludert ingen endringer i SRF, CREB eller AKT ( fig. 2B, C ). Mangelen på endring i pSRF og pCREB i NAc som respons på en kokainutfordring er i samsvar med en nylig rapport, som fant at begge ble signifikant indusert kun av kronisk kokain ( Vialou et al., 2012 ).

  

Figur 2

Effekt av tidligere kronisk kokaineksponering på oppstrøms molekylære signaleringskaskader i NAc og CPu

I NAc og CPu hos medikamentnaive dyr, 20 minutter etter en første medikamenteksponering ( fig. 2A ), reduserte en enkelt kokainutfordring nivåene av pERK42/44 ( fig. 2B, C. Tosidig Student t-test: *p <0.05). Det finnes tidligere rapporter om økte pERK-nivåer i disse regionene etter akutt kokainadministrasjon ( Valjent et al., 2000 ). Dette er vanskelig å sammenligne med andre artikler som undersøker ERK-fosforylering i NAc under abstinens fra gjentatte kokaininjeksjoner ( Boudreau et al., 2007 ; Shen et al., 2009 ), da pERK i vår studie ble kvantifisert etter 28 dager med abstinens og etter en kokain- eller saltvannsutfordring. Sammenlignet med rusmiddelnaive dyr som opplever kokain for første gang, forårsaket re-eksponering for kokain hos kokainerfarne rotter, etter 28 dager med abstinenser, en signifikant økning i pERK42/44-nivåer i CPu ( fig. 2B, C. Two tail student t-test: *p <0.05).

Kromatin landskapet på Fosb-genpromotoren i NAc og CPu av kokain-erfarne rotter

Vi undersøkte deretter om endringer i Fosb -genets induserbarhet er assosiert med endringer i kromatinstrukturen. ChIP ble utført på NAc og CPu ved bruk av antistoffer rettet mot tre godt karakteriserte former for histonmodifikasjoner: trimetylering av Lys4 av histon H3 (H3K4me3) assosiert med genaktivering, og H3K27me3 og H3K9me2 assosiert med genrepresjon. Vi analyserte kokain-naive og -erfarne rotter etter 28 dager med abstinens enten uten eller med en utfordringsinjeksjon av kokain, med dyr undersøkt 1 time senere ( fig. 3A ). I ​​NAc fant vi ingen signifikante endringer i bindingen av noen av disse tre histonmodifikasjonene til Fosb -genpromotoren i fravær av en kokainutfordring, selv om det var en trend for reduserte nivåer av H3K9me2 ( fig. 3B-D . Tosidig Student t-test. ^# p=0.2 sammenlignet med respektive legemiddelnaive kontroller). Denne effekten ble signifikant etter en kokainutfordring og var spesifikk for den proksimale promotorregionen av genet ( fig. 3C , *p < 0.05). Mens nivåene av H3K9me2 er svært lave i noen gener, viser Fosb -genpromotoren betydelige nivåer av dette merket i NAc under kontrollforhold ( Maze et al., 2010 , data ikke vist). I motsetning til dette fant vi i CPu små, men signifikante reduksjoner i H3K4me3-binding, og økninger i H3K27me3-binding, ved Fosb- promotoren i fravær av en kokainutfordring, effekter som gikk tapt etter utfordringen ( fig. 3D , *p < 0.05).

  

Figur 3

Effekt av tidligere kronisk kokaineksponering ved epigenetisk priming av Fosb gen i NAc og CPu

Vi undersøkte deretter Pol II-binding til Fosb -genet, basert på nylige funn i cellekultur som viste at stans av Pol II ved TSS-er, som er karakterisert ved fosforylering ved Ser 5 i CTD-repeatregionen, er assosiert med priming av gener (se introduksjon). Vi analyserte dermed Pol II-pSer5-binding til Fosb i fire distinkte regioner av genet ( fig. 3B ). Denne analysen avdekket en betydelig anrikning av Pol II-pSer5 ved Fosb -genet i dets proksimale promotorregion og rundt dets TSS i NAc hos kokainerfarne dyr, etter langvarig abstinens, i fravær av en kokainutfordring sammenlignet med kontrollpersoner ( fig. 3E . *p < 0.05). Denne anrikningen var ikke tydelig i to genkroppsregioner av Fosb , noe som stemmer overens med Pol II-stans beskrevet i enklere eksperimentelle systemer. Interessant nok viste Pol II-pSer5-bindingen fortsatt tegn til anriking, men ikke lenger signifikant, ved den proksimale promotorregionen til Fosb ( fig. 3E , ^% p=0.1), etter en kokainutfordring, men returnerte til kontrollnivåer ved TSS. Funnene i CPu var mer variable, uten noe klart mønster av Pol II-pSer5-binding observert.

Diskusjon

Denne studien gir ny innsikt i den vedvarende reguleringen av Fosb uker etter opphør av gjentatt eksponering for kokain. Vi viser at tidligere kronisk kokainadministrasjon gjør Fosb -genet mer induserbart i NAc, noe som resulterer i raskere akkumulering av ΔFosB ved re-eksponering for stoffet. Gitt den overvektige bevismengden for at ΔFosB-induksjon i NAc medierer sensibiliserte atferdsresponser på kokain ( Nestler, 2008 ), avslører funnene våre en ny mekanisme for raskere gjeninnsettelse av slike sensibiliserte responser etter langvarig abstinens.

Vi demonstrerer at den forbedrede induksjonen av ΔFosB i NAc er assosiert med kromatinendringer ved Fosb- genet som forventes å forberede det for større induksjon. Dermed viser vi økt Pol II-binding til den proksimale promoteren og TSS-regionene i genet som er tilstede etter 4 ukers seponering fra tidligere kronisk kokainadministrasjon. Slik Pol II-anriking ved TSS går raskt tapt ved kokainutfordring og Fosb- induksjon, i samsvar med en modell i cellekultur som frigjør stoppet Pol II fra TSS-er ved genaktivering (se introduksjon). En kokainutfordring induserer også en rask reduksjon i binding av H3K9me2 – et tegn på genundertrykkelse – til Fosb- promotoren. I motsetning til dette oppdaget vi ingen varig induksjon av flere transkripsjonsfaktorer, eller av deres oppstrømskinaser, som er kjent for å mediere Fosb -induksjon av kokain. Disse resultatene støtter vår hypotese om at den forbedrede induksjonen av ΔFosB i NAc medieres via epigenetisk priming av Fosb- genet og ikke via oppregulering av oppstrømshendelser.

Svært forskjellige resultater ble oppnådd for CPu. Det var ingen bevis for at Pol II stoppet opp ved Fosb hos kokainerfarne rotter før en kokainutfordring, selv om det var små, men signifikante histonmodifikasjoner som var forenlige med genundertrykkelse: økt H3K27me3-binding og redusert H3K4me3-binding. Det var heller ingen endring i oppstrøms transkripsjonsfaktorer eller kinaser som var forenlig med redusert Fosb- induksjon. Disse funnene tyder på at etter kronisk kokainadministrasjon tjener epigenetiske modifikasjoner til å dempe Fosb -geninduserbarheten i CPu, i motsetning til primingen som sees i NAc. Selv om disse effektene undertrykker ΔFosB mRNA-induksjon ved re-eksponering for kokain, er det imidlertid ikke noe tap i akkumulering av ΔFosB-protein. Mekanismen som ligger til grunn for dette paradokset krever nå videre undersøkelse.

Mer generelt støtter våre resultater en modell hvor endringer i kromatinlandskapet ved spesifikke gener som svar på kronisk kokainadministrasjon tjener til å prime eller knuse disse genene for påfølgende induksjon ved gjeneksponering for stoffet. Slike kromatinforandringer, som kan betraktes som "epigenetiske arr", vil bli savnet i analyser av steady-state mRNA-nivåer av gener. På denne måten lover karakterisering av epigenom av avhengighet å avsløre ny informasjon om den molekylære patogenesen av forstyrrelsen, som kan utvinnes for utvikling av nye behandlinger.

Takk til

Referanser