KOMMENTARER: Studie fant at selvadministrering av alkohol induserte en uttalt akkumulering av deltafosb. Spesielt anvendt elektroakupunktur hemmet alkoholforbruket sterkt, noe som ble parallelt med en nedgang i deltafosb. I avhengighet blokkerer DeltaFosB, de viktigste effektene av narkotikaeksponering. Virkningsmekanismen antyder at elektroakupunktur undertrykker dopamin, og dermed hemmer akkumulering av deltfosb.
Kilde
Institutt for anestesiologi, farmakologi og fysiologi, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, New Jersey Medical School, Newark, New Jersey, USA.
Abstrakt
Det trengs nye terapier for alkohol misbruk, et stort folkehelseproblem i USA og over hele verden. Det er bare tre FDA-godkjente legemidler for behandling av alkohol misbruk (naltrexon, acamprosate og disulfuram). I gjennomsnitt gir disse stoffene bare moderat suksess i å redusere langsiktig alkohol forbruk. elektro har vist seg å lindre ulike rusmidler, inkludert alkohol. Selv om tidligere studier har vist det elektro redusert alkohol forbruk, har de underliggende mekanismene ikke blitt fullstendig belyst. ΔFosB og FosB er medlemmer av Fos-familien av transkripsjonsfaktorer involvert i nevral plastisitet ved narkotikaavhengighet; en sammenheng mellom elektrosin behandling av alkohol overgrep og Fos-familien er ikke etablert. I denne studien trente vi rotter til å drikke store mengder etanol i en modifisert drikkeprosedyre med to flasker med intermitterende tilgang. Når rotter oppnådde en stabil baseline av etanol forbruk, elektro (100 Hz eller 2 Hz, 30 minutter hver dag) ble administrert ved Zusanli (ST36) i 6 påfølgende dager. Nivået på FosB/ ΔFosB in belønne-i slekt hjerne regioner ble vurdert ved immunhistokjemi. Vi fant at inntak av og preferanse for etanol hos rotter under 100 Hz, men ikke 2 Hz elektro regimentet ble kraftig redusert. De reduksjon ble opprettholdt i minst 72 timer etter avslutningen av elektro behandling. Omvendt, 100 Hz elektro endret ikke inntaket av og preferansen for det naturlige givende middelet sukrose. I tillegg FosB/ ΔFosB nivåer i den prefrontale cortex, striatalregionen og den bakre regionen av ventrale tegmentale området økte etter overdreven etanol forbruk, men ble redusert etter seks dagers 100 Hz elektro. Dermed viser denne studien at seks dagers 100 Hz elektro behandling reduserer etanol effektivt forbruk og preferanse hos rotter som drikker kronisk overdreven mengde etanol. Denne effekten av elektro kan formidles ved nedregulering av FosB/ ΔFosB in belønne-i slekt
Introduksjon
Alkoholmisbruk er et stort folkehelseproblem i USA og verden over. Til dags dato finnes det bare tre FDA-godkjente legemidler for behandling av alkoholmisbruk (naltrekson, acamprosat og disulfuram). I gjennomsnitt gir disse legemidlene bare moderat suksess med å redusere langsiktig alkoholforbruk [1] , [2] , [3] . Derfor er det behov for nye terapier. Akupunktur, som består av å stimulere visse punkter på kroppen ved hjelp av nåler, har blitt brukt i Kina i tusen år. Selv om det fortsatt ikke er helt klart hvordan akupunktursignalene fra akupunkturpunktet, som Zusanli (ST36), overføres til sentralnervesystemet, har det blitt karakterisert at de afferente impulsene indusert av akupunktur hovedsakelig overføres av Aβ- og AΔ-fibre [4] . Akupunktur aktiverer små myeliniserte nervefibre i muskelen, som sender impulser til ryggmargen, og aktiverer deretter tre sentre (ryggmarg, mellomhjerne og hypofyse-hypothalamus) og frigjøring av tre endorfiner (enkefalin, beta-endorfin og dynorfin) og andre monoaminer, noe som fremkaller dyptgående fysiologiske effekter og selvhelbredende mekanismer [5] . Akupunktur har derfor blitt ansett som et effektivt middel for noen medisinske tilstander, inkludert kvalme, smerte [6] og rusmisbruk [7] . Sammenlignet med de nåværende tilgjengelige farmakologiske intervensjonene, er en klar fordel med akupunkturbehandling at den har potensial til å hjelpe rusmisbrukere med å holde seg unna rusmidler uten større negative bivirkninger. Tidligere kliniske og prekliniske studier har vist at akupunktur eller akupunktur kombinert med elektrisk stimulering (elektroakupunktur, EA) er en effektiv behandling for alkoholabstinenssyndrom og alkoholmisbruk [8] , [9] . Nylig har vi vist at EA på 2 Hz reduserte frivillig alkoholinntak hos rotter [14] . Imidlertid har mange spørsmål angående de grunnleggende mekanismene for akupunktur generelt og alkoholmisbruk spesielt blitt godt besvart.
Undersøkelser av langsiktige endringer i hjernestruktur og -funksjon som følger med kronisk eksponering for rusmidler, tyder på at endringer i genregulering bidrar vesentlig til den avhengighetsskapende fenotypen [15] . Spesielt to transkripsjonsfaktorer – ΔFosB og CREB (cAMP responsive element binding protein) – har blitt implisert i avhengighetsrelatert nevral plastisitet [15] . Transkripsjonsfaktoren ΔFosB, en uvanlig stabil, C-terminalt avkortet variant av det umiddelbare tidlige genproduktet FosB, akkumuleres i avhengighetskretsløpet etter de fleste rusmidler, inkludert kokain, morfin, Δ9 - tetrahydrocannabinol og etanol [16] . Når den først er uttrykt, er den relativt stabil og kan vedvare i hjernen i uker etter siste rusmiddeleksponering. Ved å regulere en rekke gener som er relatert til dendrittisk ryggradsarkitektur og synaptisk funksjon og plastisitet, slik som cyklinavhengig kinase 5 og dynorfin [17] , [18] , medierer ΔFosB den synaptiske plastisiteten som bidrar til ulike atferdsfenotyper som respons på rusmiddeleksponering. Tidligere studier fra våre og andre laboratorier har vist at kronisk alkoholeksponering induserer akkumulering av ΔFosB i underregionene av striatum og prefrontal cortex (PFC) [16] , [19] , noe som involverer aktivering av endogene opioidsystemer [19] . Gitt at eksisterende bevis indikerer at EA lindret alkoholforbruk og morfinavhengighet via interaksjon med opioidreseptorer [12] , [20] , [21] ; og at akupunktur demper stressindusert kokaintilbakefall ved å undertrykke Fos-ekspresjon og CREB-aktivering i underregionene av striatum [22] , antok vi at EA-undertrykkelse av alkoholforbruk kan være mediert av transkripsjonsfaktorer, som FosB/ΔFosB-protein i belønningsrelaterte hjerneområder. For å teste denne muligheten ble flere økter med EA administrert ved det bilaterale akupunkturpunktet ST36 hos rotter som kronisk drikker store mengder etanol under en modifisert intermittent tilgang med to flasker (IE). Ekspresjonen av FosB/ΔFosB i flere belønningsrelaterte hjerneområder ble vurdert ved hjelp av immunhistokjemi, som har høyere sensitivitet enn Western blotting og gir større anatomiske detaljer [23].
Metoder
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene til National Institutes of Health for Care and Use of Laboratory Animals, og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Medicine and Dentistry i New Jersey, Newark, New Jersey.
Dyr og boliger
Voksne Sprague-Dawley (SD) rotter (250–350 g, ved starten av eksperimentene, Taconic Farm, NY) ble individuelt plassert i ventilerte bur, i et klimakontrollert rom (20–22 °C), holdt på en 12-timers lys/mørke-syklus (lys av kl. 6). Mat og vann var tilgjengelig ad libitum.
Alkoholdrikkingsprosedyre
Dyrene ble først akklimatisert til hjemmeburmiljøet i en uke, og ble opplært til frivillig å drikke etanol under den periodiske drikkeprosedyren med to flasker som beskrevet tidligere [14], [19], [24], [25], [26]. Kort fortalt ble dyr gitt 24-timers samtidig tilgang til en flaske med 20% (v/v) etanol i vann og en flaske vann, med start klokken 6:00 på mandag. Etter 24 timer ble etanolflasken erstattet med en andre vannflaske som var tilgjengelig de neste 24 timene. Dette mønsteret ble gjentatt på onsdager og fredager. De andre dagene i uken hadde rottene ubegrenset tilgang til to flasker med vann. De dagene da etanol kunne vurderes for rottene, ble plasseringen av etanolflasken vekslet for å kontrollere for sidepreferanser. I denne studien modifiserte vi prosedyren ved å tilsette 5% sukrose til 20% etanolløsningen i de tre første etanoløktene. Denne modifikasjonen akselererte raskt og kraftig etanolinntaket (Fig. 1). Mengden etanol eller vann som ble konsumert ble bestemt ved å veie flaskene før tilgang og etter 24 timers tilgang. Vekten til hver rotte ble målt daglig mandag til fredag for å overvåke helsen og beregne gram etanolinntak per kilo kroppsvekt. Etanolforbruket ble bestemt ved å beregne gram alkohol konsumert per kilo kroppsvekt. Preferanseforholdet for etanolinntak ble beregnet ved hjelp av følgende formel: Preferanseforhold (%) 
= Inntak av etanolløsning (ml/24 timer)/totalt væskeinntak (ml/24 timer etanolløsning + ml/24 timer vann). Rotter ble opprettholdt på 20 % etanol med intermitterende tilgang til to-flaskevalgsprosedyre i 4 uker (12 økter med etanoltilgang). En flaske med vann i et bur uten rotter ble brukt til å evaluere søl på grunn av de eksperimentelle manipulasjonene under testøktene. Sølet var alltid <1.0 ml (<2.5 % av det totale væskeinntaket).
Figur 1
Etanolkonsentrasjoner i blodet (BEC)
På 13th etanoldrikking, ble blodprøver tatt fra den laterale halevenen til rotter (n=11) etter 30 min tilgang til 20 % etanol og vann. Prøvene ble sentrifugert ved 4°C i 15 minutter ved 8000 rpm, og 10 µl plasma fra hver blodprøve ble analysert ved bruk av nikotinamid adenin dinukleotid-alkohol dehydrogenase (NAD-ADH) enzymspektrofotometrisk metode [27].
Sykrose-selvadministrasjon
For å bestemme om EA-indusert reduksjon i drikking var selektiv for alkohol, en egen gruppe (n=8) av rottene ble opplært til å drikke 5 % sukroseløsning under periodisk tilgang til to-flaskevalgsdrikkingsprosedyre, lik den for alkoholdrikking. 5% sukrose ble valgt i henhold til våre tidligere studier [25], [26] og en fersk gnagerstudie på effekten av opioidreseptorantagonistene, SoRI-9409 på alkoholinntak [28]. Når SD-rotter hadde nådd et konsistent basislinjenivå etter 12 drikkeøkter med tilgang til sukrose og vann, ble 100 Hz EA eller shamprosedyrer utført som beskrevet nedenfor.
EA-behandlinger
For å teste effekten av EA på etanolinntak hos rotter som kronisk konsumerte høye mengder etanol, ble 100 Hz EA administrert ved bilateral ST36, lokalisert nær kneleddet til bakbenet, 2 mm lateralt til fremre tuberkel av tibia; EA ble påført 30 minutter hver dag, 30 minutter før tilgang til etanol, i 6 påfølgende dager (onsdag til mandag, tre påfølgende drikkeøkter).
Alle rottene ble forhåndshåndtert i 2 minutter/dag i 3 påfølgende dager før EA-behandlinger for å redusere stress og lette håndteringen. På testdagen, under lett anestesi med isofluran, ble rottene i både EA- og simuleringsgruppene lett holdt tilbake, noe som innebar at de ble festet på et stativ med et håndkle som dekket øynene, som beskrevet i vår nylige rapport [14] . Under disse forholdene var rottene rolige, og lemmene og halene deres kunne presses fritt ut. To nåler i rustfritt stål med en diameter på 0.35 mm og en lengde på 13 mm ble satt inn ca. 2–3 mm i ST36 på begge bena (for EA-gruppen). Etter at dyrene våknet fra anestesien, ble 10 minutter EA (eller simulert anestesi) administrert. En konstant strøm med firkantbølgestimulering produsert av en programmert pulsgenerator (Han Actens WQ 1002F, Aeron Optoelectronic Technology Corp., Beijing, Kina) ble gitt via de to nålene for EA-gruppen. EA-frekvensen var 100 Hz, og intensiteten ble justert for å fremkalle lett skjelving i musklene (ca. 0.2–0.3 mA). For simulert gruppe ble nåler plassert i ikke-akupunkturpunkter på halen (1/5 halelengde fra den proksimale regionen av halen [13] , [29] ), og ingen strømstimulering ble brukt. Etanol- (eller sukrose-) og vanninntak ble deretter registrert 24 timer etter at drikkingen startet. I løpet av de 6 behandlingsdagene hadde rottene tre etanolindrikkingsøkter (dag 1, onsdag; dag 3, fredag; og dag 6, mandag). Etanolinntaket under drikkeøkten rett før EA-administrering og etter den siste EA-administreringen ble registrert henholdsvis som baseline eller etterbehandlingsbaseline drikkenivå. Effektene av flere økter med lavfrekvent EA (2 Hz) på etanolinntak hos rotter som kronisk konsumerte høye mengder etanol ble kontrollert i en separat gruppe rotter, hvor 2 Hz EA ble administrert ved bilateral ST36 (30 min hver dag) i seks påfølgende dager. Etanol- og vanninntak ble registrert som i eksperimentet ovenfor.
immunhistokjemi
Vi har nylig rapportert at kronisk etanolinntak induserer akkumulering av FosB/ΔFosB på en subregionsspesifikk måte [19]. For å bestemme om EA-indusert reduksjon i etanolinntak var assosiert med endringer i FosB/ΔFosB-uttrykk, analyserte vi FosB/ΔFosB-immunreaktivitet (IR) i belønningsrelaterte områder av det mesokortikolimbiske dopaminsystemet. En gruppe rotter (n=12) ble først opplært til å drikke etanol ved å bruke det modifiserte drikkeparadigmet med to flasker med intermitterende tilgang som beskrevet ovenfor. Når rotter frivillig inntok store mengder etanol, ble de delt inn i to undergrupper: en (n)=6) mottok 100 Hz EA ved bilateral ST36, den andre falske behandlingen ved halen (n=6) i 6 påfølgende dager. I løpet av de 6 behandlingsdagene hadde rottene tre økter med etanoldrikking (dag 1, onsdag; dag 3, fredag; og dag 6, mandag). Rotter i kontrollgruppen (etanolnaiv kontroll, n=5) fikk tilgang til vann og mat uten begrensning. Det var ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt mellom de etanolnaive og etanoldrikkende rottene ved slutten av forsøkene.
Etanoldrikkende rotter behandlet med EA eller sham ble ofret umiddelbart etter den siste økten med 24 timers etanoltilgang. Etanolnaive rotter ble også ofret på samme tidspunkt. Rotter ble overdosert med ketamin/xylazin (80 mg/10 mg/kg, ip) og transkardialt perfusert med kald saltvann etterfulgt av 4 % paraformaldehyd i 0.1 M natriumfosfatbuffer (pH 7.4). Hjerner ble fjernet, etterfiksert (2 timer, ved 4°C) i samme fikseringsløsning og kryobeskyttet (over natten ved 4°C, 20 % sukrose i 0.1 M fosfatbuffer, pH 7.4). Serielle 30 µm koronale seksjoner av forhjernen ble kuttet på en frysemikrotom (Microm HM550, Walldorf og German), og en 1-i-4 serie med hjerneseksjoner ble behandlet for immunhistokjemisk påvisning av FosB/ΔFosB-protein. Seksjoner ble inkubert i følgende serie antistoffer: pan-FosB antistoff (1![[forhold]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
2000, #sc-48; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) over natten, ved 4 °C, biotinylert anti-kanin IgG (2 timer, 1200) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Seksjoner ble deretter inkubert i en avidin-biotin-pepperrotperoksidase-kompleksløsning (45 min) (Vector Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, California). Pepperrotperoksidaseaktivitet ble visualisert med nikkel-diaminobenzidin (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Seksjoner fra hver forsøksgruppe ble behandlet samtidig. Utelatelse av de primære antisera på en undergruppe av seksjoner resulterte i tap av immunreaktivitet. Seksjoner ble montert på krom-alun-objektglass, dehydrert og dekselet skled.
Kvantisering av FosB/ΔFosB-immunreaktivitet
Endringer i FosB/ΔFosB-immunreaktivitet ble målt i snitt fra prefrontale korteks (PrL, IL og orbitofrontal cortex (OFC)), NAc (kjerne og skall) og dorsolateral striatum (DLS) og dorsomedial striatum (DMS). Disse hjerneområdene ble identifisert basert på Atlas of Paxinos og Watson [30] . Kvantitativ måling ble utført ved hjelp av et assistert bildeanalysesystem, bestående av et Nikon Eclipse 80i lysfeltmikroskop (Micron Optics, Cedar Knoll, NJ) koblet til et fargedigitalkamera Nikon DS-Ri1 (Micron Optics, Cedar Knoll, NJ), og en datamaskin med en NIS-Elements BR 3.0-programvare (Micron Optics, Cedar Knoll, NJ). Bilder ble tatt med 20× forstørrelse og gjennomsnittet ble beregnet fra høyre og venstre hjernehalvdel hos hver forsøksperson. Todimensjonale tellinger av merkede kjerner fra hvert bilde [200×bilder (0.1 mm² - område) av FosB/ΔFosB-lignende immunreaktive kjerner i hjerneområder av interesse] ble bestemt uten kjennskap til behandlingsforhold fra tre separate seksjoner per dyr ved bruk av NIS-Elements BR 3.0-programvare.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil for gjennomsnittet). Atferdsdata ble analysert med toveis repeated measurement ANOVA (RM ANOVA) med hovedfaktorene for behandling (EA eller sham) og dager [baseline (0 dag), dag 1, 3, 5, postbaseline (7 dag)]. Tukey post hoc- analyse ble utført ved hjelp av kontrastanalyse når dag × behandlingsinteraksjon var p <0.05. Immunhistokjemiske resultater ble analysert med enveis ANOVA etterfulgt av Tukey-test.
Resultater
Intermitterende tilgang til 20 % etanol (IE) med sukrose tilsatt i de tre første drikkeøktene induserer overdrevent forbruk og høy preferanse for etanol hos SD-hannrotter
Vi har tidligere vist at IE-prosedyren førte til at flertallet av SD-rottene drakk moderate nivåer av etanol [14]. I denne studien tilsatte vi 5 % sukrose i de tre første drikkeøktene, noe som i stor grad økte mengden etanol som ble konsumert av SD-rotter som varte i >3 uker etter sukroseabstinens (Fig. 1A). Under disse forholdene, på 4th til 12th drikkeøkter, konsumerte SD-rotter 8.2±0.1 g/kg/24 timer, som var vesentlig større enn 4.1±0.1 g/kg/24 timer, konsumert av rotter under den samme prosedyren, men uten sukrose-induksjon. Toveis RM ANOVA avslørte betydelige hovedeffekter for behandling (F1, 337=269.63, p<0.001), dag (F11, 337=2.09, p<0.05), og behandling × dag interaksjon (F11, 337=6.51, p Post-hoc analyse av den gjennomsnittlige mengden etanol konsumert av rotter ved 4th til 12th drikkeøkter viste signifikant forskjell mellom grupper med og uten sukrose-induksjon.
Preferansen for etanol hos rotter med sukroseinduksjon var også større enn hos de rottene uten sukroseinduksjon (Fig. 1B). I løpet av 4th til 12th økter, var den gjennomsnittlige preferansen for etanol henholdsvis 36.4±0.4 % og 22.0±0.8 % for rotter med og uten sukrose-induksjon. Toveis RM ANOVA avslørte betydelige hovedeffekter for behandling (F1, 337=125.73, p<0.001) og behandling × tidsinteraksjon (F11, 337=5.08, p<0.001) med sterk tendens til tid (F11, 337=1.79, p=0.05). Post-hoc analyse av preferansen for etanol ved 4th til 12th drikkeøkter var signifikant høyere hos rotter med sukrose enn hos rotter som ikke fikk sukrose (alle p<0.001, Fig. 1B).
Vi målte BEC for rotter fra sukroseinduksjonsdrikkegruppen beskrevet ovenfor ved den 13. drikkeøkten umiddelbart etter den 30-minutters perioden med tilgang til etanol. BEC varierte fra 26.8 til 136.0 mg% med et gjennomsnitt på 60.5±10.4 mg%. Det var en signifikant positiv korrelasjon mellom BEC og g/kg etanol konsumert (r2=0.75, n=11, p<0.001; data ikke illustrert).
Flere økter med høy (100 Hz), men ikke lavfrekvent (2 Hz) EA-behandling reduserer overdreven forbruk av og preferanse for etanol, men ikke sukrose
En fersk rottestudie fant at flere økter med høyfrekvent (100 Hz) EA var mer effektiv enn en enkelt økt med høyfrekvens (100 Hz) for å lindre morfinabstinenssyndrom. Videre varte ettervirkningen av flere økter EA i minst 7 dager [31]. Vi forsøkte å finne ut om flere økter med 100 Hz EA-behandling kan endre etanolforbruket hos rotter som kronisk drikker store mengder etanol. Vi brukte flere økter med 100 Hz EA ved ST36 eller sham på rotter når de hadde nådd stabile grunnlinjenivåer av etanolforbruk (se Fig. 1). Som vist i Fig. 2A, påfølgende 6-dagers 100 Hz EA, 30 minutter hver dag, men ikke den falske behandlingen reduserte etanolforbruket betydelig over den 24-timers tilgangsperioden. Toveis RM ANOVA avslørte betydelige hovedeffekter av behandlingen (F1, 51=18.59, p<0.001), dag (F4,51=9.81, p<0.001) og behandling × dag interaksjon (F4,51=5.31, p=0.001). Post hoc analyse avslørte at etanolinntaket i løpet av 24-timers tilgangen på dag 3 og 6 var klart redusert i EA-behandlingsgruppen sammenlignet med sham (alle p<0.001, Fig. 2A). Bemerkelsesverdig nok, når EA-behandlinger ble avsluttet på dag 6, ble reduksjonen opprettholdt ved 48-72 timers drikkeøkt etter siste EA-administrasjon (p<0.01, EA vs humbug, Fig. 2A). Det var ingen generell hovedeffekt av falsk behandling på etanolinntak på alle testdagene sammenlignet med baseline drikkenivåer.
Figur 2
Selv om preferanseforholdet for etanol ved 24-timers undersøkt tidspunkt ikke var signifikant forskjellig blant gruppene i løpet av den EA-frie grunnlinjeperioden, ble dette forholdet betydelig redusert etter gjentatt administrering av 100 Hz EA. Toveis RM ANOVA avslørte betydelige hovedeffekter av behandlingen (F1,51=11.22, p=0.004), dag (F4,51=5.49, p<0.001, og interaksjonsbegrepet (F1,51=5.66, p Post hoc analyse avslørte at preferansen for etanol ved 24-timers tidspunkt på dag 3 og 6 i de flere øktene til 100 Hz EA-behandlet gruppe var lavere enn for sham (alle p<0.001, Fig. 2B). Videre ble EA-indusert reduksjon i preferanseforhold opprettholdt ved 48–72 timers drikkeøkt da EA-administrasjoner ble avsluttet (p<0.05, EA vs humbug, Fig. 2B). Det var ingen generell hovedeffekt av falsk behandling på preferansen for etanol på testdager sammenlignet med baselinepreferanse for etanol (Fig. 2B). Interessant nok ga påfølgende 6-dagers 100 Hz EA-behandling også betydelige effekter på vanninntaket (hovedeffekten av behandlingen [F1,51=5.21, p<0.05] og dag [F4,51=2.97, p<0.05], uten effekt av behandling × tidsinteraksjon [F4,51=1.23, p=0.31]) (Fig. 2C). Vanninntaket ved 24-timers tidspunkt på dag 5 og 7 var signifikant økt hos EA-behandlede rotter sammenlignet med sham (p<0.05). På alle testdagene ble det totale væskeinntaket ikke påvirket av påfølgende 6-dagers 100 Hz EA sammenlignet med falsk behandling (Fig. 2D).
Vi har tidligere vist at enkelt lav, men ikke høyfrekvent EA reduserte moderat etanolforbruk [14]. For å bestemme om effekten av flere økter med EA også avhenger av frekvensen, ble flere økter med lavfrekvent (2 Hz) EA ved ST36 administrert til rotter som kronisk konsumerte store mengder etanol under IE-prosedyren med sukrose-induksjon som beskrevet ovenfor. Som illustrert i Fig. 3A, under disse eksperimentelle forholdene, endret ikke flere økter med 2 Hz EA etanolinntaket i løpet av den 24-timers tilgangsperioden på alle testdagene (Fig. 3A). Toveis RM ANOVA for etanolforbruk klarte ikke å avsløre hovedeffektene av behandlingen (F1, 37=1.43, p>0.05), dag (F3,37=1.15, p>0.05) og behandling × tidsinteraksjon (F3,37=0.25, p>0.05). Følgelig endret ikke flere økter med 2 Hz EA preferanseforholdet for etanol ved 24-timers tidspunktet på alle testdagene [ingen hovedeffekter av behandling (F1, 37=0.003, p=0.95), dag (F3,37=0.54, p=0.65) eller behandling × tidsinteraksjon (F3,37=0.30, p=0.82) Fig. 3B]; eller vanninntak og total væske (data ikke vist).
Figur 3
For å bestemme om reduksjonen i etanolforbruk indusert av flere økter med 100 Hz EA er spesifikk for etanol, målte vi inntaket av foretrukket substans sukrose ved å bruke en intermitterende tilgang til 5% sukrose i en to-flaskevalgs drikkeprosedyre. Som vist i Fig. 4, ble verken sukroseinntak eller preferanse for sukrose ved 24-timers tidspunkt endret av flere økter med 100 Hz EA ved ST36. Toveis RM ANOVA for sukroseforbruk klarte ikke å avsløre hovedeffektene av behandlingen (F1, 18=0.23, p=0.65), dag (F3,18=1.39, p=0.27) eller behandling × tidsinteraksjon (F3,18=0.19, p=0.90). Videre ble det ikke funnet noen signifikant forskjell mellom EA og sham for verken vannforbruk eller total væske (data ikke vist).
Figur 4
Flere økter med 100 Hz EA reduserer overdreven etanolforbruk-indusert akkumulering av FosB/ΔFosB i spesifikke belønningsrelaterte hjerneregioner
Resultatene beskrevet ovenfor viste at påfølgende 6-dagers 100 Hz EA selektivt reduserte inntaket av og preferansen for etanol hos rotter som kronisk drikker store mengder etanol. Mange studier har antydet at vedvarende aktivering av ΔFosB kan være en vanlig vei for avhengighetslidelser [32] . Vi har tidligere rapportert at kronisk etanolforbruk induserer ΔFosB-akkumulering selektivt i prefrontal cortex og striatalregionen [19] ; dysfunksjon av disse belønningsrelaterte hjerneområdene er assosiert med etanolentrang og svekkelse av nye læringsprosesser hos avholdende alkoholikere [33] . Derfor vurderte vi FosB/ΔFosB IR i følgende belønningsrelaterte hjerneområder i det mesokortikolimbiske dopaminsystemet ( fig. 5 ).
Figur 5
Striatal regionen
FosB/ΔFosB-ekspresjon ble regulert differensielt innenfor striatalregionen som en funksjon av både etanol- og EA-behandling. I tråd med vår ferske rapport [19], FosB/ΔFosB IR økte kraftig innenfor kjernen av nucleus accumbens (NAc-Core) og dorsolateral striatum (DLS) (Fig. 6), men ikke innenfor dorsalskallet (NAc-Shell) og dorsomedial striatum (DMS) hos dyr som kronisk konsumerte store mengder etanol med falsk behandling, sammenlignet med etanolnaive kontroller. Flere økter på 100 Hz EA reduserte FosB/ΔFosB IR betydelig i DLS og NAc-Core indusert av langvarig overdreven etanolforbruk (Fig. 6). Disse observasjonene støttes av enveis ANOVA som avslørte en signifikant hovedeffekt av behandling i NAc-Core (F2, 33=6.27, p=0.005) og DLS (F2, 33=28.54, p<0.001), men ikke i NAc-skall (F2, 33=1.36, p>0.05) og DMS (F2,33=2.47, p> 0.05).
Figur 6
Prefrontal cortex
Vi rapporterte nylig at kronisk etanoleksponering kraftig øker FosB/ΔFosB IR i orbitofrontal cortex (OFC), men ikke den mediale prefrontale cortex [19]. I den nåværende studien ble imidlertid FosB/ΔFosB IR betydelig økt i både det prelimbiske området av den prefrontale cortex (PrL) og OFC hos dyr som kronisk konsumerte store mengder etanol med falsk behandling (Fig. 7, p<0.001 falsk vs etanol naiv). Ingen statistiske forskjeller i FosB/ΔFosB-positive kjernetellinger ble funnet mellom den falske gruppen og den etanolnaive kontrollgruppen i det infralimbiske området av den prefrontale cortex (IL). Flere økter med 100 Hz EA reduserte FosB/ΔFosB IR betydelig i PrL, OFC og IL (alle p<0.01 EA-gruppe vs humbug). Følgelig ga enveis ANOVA en signifikant hovedeffekt av behandling ved IL (F2, 33=7.06, p=0.003), PrL (F2, 33=18.61, p<0.001) og OFC (F2, 33=13.23, p
Figur 7
Det ventrale tegmentale området (VTA)
VTA antas å være en kritisk hjerneregion for belønning. En fersk studie viste at kronisk psykostimulerende administrering induserer akkumulering av ΔFosB, spesielt i den bakre halen av VTA [23], [34]. Som illustrert i Fig. 8, FosB/ΔFosB IR i den bakre regionen av VTA (Bregma − 5.20 mm til Bregma −6.8 mm) ble kraftig økt hos rotter som kronisk konsumerte store mengder etanol sammenlignet med den i etanolnaive gruppe (p<0.001), og ble betydelig redusert etter flere økter med EA (p<0.001, EA-gruppen vs sham), men ikke etter sham-behandling. Det var en generell hovedeffekt av behandling på FosB/ΔFosB IR i bakre VTA (F2,33=12.04, p<0.001, Fig. 8).
Figur 8
Diskusjon
Vi rapporterte her at seks dagers 100 Hz EA (30 minutter hver dag) ved det bilaterale akupunkturpunktet ST36 selektivt reduserte overdreven forbruk av og preferanse for etanol over 24 timers tilgangsperiode. Reduksjonen opprettholdt i minst 72 timer etter avsluttet EA-behandling. Videre reduserte dette EA-regimentet FosB/ΔFosB-ekspresjon indusert av kronisk etanoleksponering i de belønningsrelaterte hjerneområdene.
Vi har nylig rapportert at en enkelt 20-minutters lavfrekvent (2 Hz), men ikke høyfrekvent (100 Hz) EA ved ST36 reduserte det moderate inntaket av etanol hos SD-rotter [14] . Det finnes nyere bevis for at flere økter med høyfrekvent EA er mer effektive enn én økt med høyfrekvent EA for å lindre morfinabstinenssyndrom [31] . I denne studien undersøkte vi om 100 Hz EA var effektivt for å redusere overdrevent etanolforbruk hos rotter under en modifisert IE-drikkeprosedyre, der alle rotter konsumerte store mengder etanol (8.2 ± 0.1 g/kg) med høy preferanse for etanol (36.4 ± 0.4 %). Selv om vi ikke overvåket abstinenstegn i den nåværende studien, har vi tidligere rapportert at rotter under det lignende drikkeprogrammet viste milde abstinenstegn [14] , [25] . BEC hos rotter i den nåværende studien var 60.5 ± 10.4 mg %, som var nesten dobbelt så høyt som hos SD-rotter [14] og likt som hos Long-Evans-rotter [25] som viste abstinenstegn. Det er derfor høyst mulig at rotter under de nåværende forsøksforholdene kan utvikle etanolavhengighet og ha tegn på abstinenser. Bemerkelsesverdig nok reduserte seks dagers påfølgende 100 Hz EA inntaket av fritt etanol med nesten halvparten i løpet av den 24 timer lange tilgangsperioden. Interessant nok økte dette EA-regimet også vanninntaket betydelig, noe som tyder på at disse dyrene gikk i motsatt retning av etanolindrikking. Viktigere er det at reduksjonen i etanolinntak ble opprettholdt i > 72 timer etter at EA-behandlingene var avsluttet. Omvendt endret ikke flere økter med 100 Hz EA inntaket av og preferansen for det naturlige belønningsstoffet sukrose. Vårt nåværende funn er i tråd med en nylig studie som viser at flere økter med EA dempet morfinabstinenssyndromet, som ble opprettholdt i minst 7 dager i en behandlingsfri periode. Denne langvarige effekten av EA kan tilskrives den økte dynorfinnivået, siden flere økter med 100 Hz EA er svært effektive i å akselerere biosyntesen av dynorfin, noe som gjenspeiles i den raske oppreguleringen av preprodynorfin mRNA, som ble opprettholdt i minst 7 dager i hjernen [31].
Tidligere bevis indikerer at dynorfin frigjort i CNS, via interaksjon med κ-opioidreseptor (KOR), spiller en viktig rolle i 100 Hz EA-indusert undertrykkelse av morfinabstinenssyndrom [20] , [35] , [36] . Videre ble det vist at flere økter med 100 Hz EA var mer effektive enn enkelt EA i å blokkere nedreguleringen av preprodynorfin mRNA indusert av kronisk morfineksponering [31] . Det har blitt vist at dynorfin-κ opioidsystemer kan ha en viktig rolle i å drive tvangsinntak av rusmidler [37] . Ekspresjonen av dynorfin og KOR-er var lavere hos gnagere som konsumerte høye nivåer av etanol enn deres lavdrikkende motparter [38] , [39] , [40] . Videre reduserer systemisk administrering av KOR-agonisten U50,488H hos rotter etanolinntaket betydelig [41] , mens administrering av KOR-antagonisten øker etanolinntaket [42] . Det er viktig å merke seg at polymorfismer i dynorfin og KOR har vært assosiert med økt risiko for alkoholisme hos mennesker [43] . Samlet sett tyder disse dataene på en modulerende rolle for dynorfin fremfor etanolindrikking, der dynorfin/KOR-systemet fungerer for å redusere etanolindrikking. Siden 100 Hz EA spesifikt kan legge til rette for frigjøring av dynorfin [44] , antok vi at dynorfin medierer i det minste delvis reduksjonen i etanolforbruk indusert av 100 Hz EA observert i den nåværende studien. Mekanismen som ligger til grunn for den dynorfinmedierte reduksjonen i etanolforbruk er imidlertid ikke helt klar. En reduksjon i etanolforbruk indusert av økningen av dynorfin ble også observert i tidligere studier [45] , [46] . Disse forfatterne tolket dataene sine til å indikere at dynorfin kan gi postestiv tilbakemelding for å regulere påfølgende etanolforbruksperioder.
Predynorfin-genet er et av transkripsjonsmålene for ΔFosB [18] , [32] . Overekspresjon av ΔFosB i NAc og dorsalstriatum økte lokomotorisk aktivitet og givende responser på morfin, delvis gjennom undertrykkelse av dynorfin-ekspresjon [18] . Siden 100 Hz EA akselererte frigjøringen av dynorfin i ryggmargen og gjenopprettet ekspresjonen av prodynorfin-genet i hjernen hos morfinavhengige dyr [31] , [36] , foreslår vi at 100 Hz EA kan endre funksjonen til ΔFosB i hjernen.
Denne studien viser at ΔFosB-transkripsjonsfaktorer i prefrontal cortex, striatalregionen og den posteriore VTA kan spille en viktig rolle i 100 Hz EA-indusert reduksjon av overdrevent etanolinntak . Den fremhever at EA-indusert reduksjon av etanolforbruk kan involvere ulike veier som bidrar til etanolindrikking, inkludert kognitive, motivasjonsmessige og motoriske nevrale kretser. NAc-kjernen kan bidra til betinget stimulusstøttet rusmiddelsøkende atferd [47] . På samme måte kan dorsal striatum bidra til den kompulsive eller vanelignende naturen til rusmiddelforbruk [48] . De laterale (DLS) og mediale (DMS) delene av dorsal striatum har distinkte anatomiske input og output og derfor forskjellige funksjoner [49] . For eksempel kontrollerer endogen hjerneavledet nevrotrofisk faktor i DLS, men ikke i DMS, frivillig etanolinntak [50] . I tråd med disse funnene viste vi at kronisk etanol-selvadministrering induserte uttalt akkumulering av ΔFosB i NAc-kjernen og DLS, men ikke i NAc-skallet og DMS. Viktigere er det at vi videre viste at flere økter med 100 Hz EA signifikant dempet akkumuleringen av FosB/ΔFosB IR i NAc-kjernen og DLS indusert av overdrevent etanolforbruk, og dempningen var mer signifikant i DLS enn i NAc-kjernen.
PFC er ansvarlig for eksekutive funksjoner, beslutningstaking og implementering av målrettede handlinger. Subregioner av PFC inkluderer PrL som styrer responsinitiering og IL som medierer responshemming; begge regioner styrer handlinger og utfall. PrL og IL kan fungere som av-og- på -mekanismer i både betingede medikament- og fryktresponser. Videre er subregionen av OFC en nøkkelhjerneregion involvert i regulering av målrettet atferd og impulsivitet [51] . Akkumulering av ΔFosB i PFC antas å være direkte involvert i vedlikehold av avhengighet ved å produsere toleranse for de kognitive forstyrrende effektene av medikamenter via dens virkninger i PFC [52].
Under seponering av legemidler øker overekspresjon av ΔFosB impulsiviteten, noe som ytterligere fremmer selvadministrasjon av legemidler [53] , [54] . Det er viktig at genetisk eller viral overekspresjon av ΔJunD – en dominant negativ mutant av JunD som motvirker ΔFosB og annen AP1-mediert transkripsjonsaktivitet – i OFC blokkerer disse viktige effektene av legemiddeleksponering [53] . Den nåværende studien viste at overdrevent etanolinntak induserte høye nivåer av ΔFosB i PrL og OFC, som ble blokkert av flere økter med 100 Hz EA. Videre, selv om FosB/ΔFosB IR i IL ikke ble endret av overdrevent etanolforbruk, ble det redusert av flere økter med 100 Hz EA.
VTA, opprinnelsen til det mesolimbiske dopaminsystemet, er kritisk for motivert atferd av misbrukte rusmidler, inkludert etanol. Tidligere har Perrotti og kolleger gitt bevis for at uttrykket av FosB/ΔFosB i den posteriore/hale VTA økte etter akutt eller kronisk eksponering for flere psykostimulerende midler som kokain og amfetamin. Viktigere er at uttrykket i hovedsak presenteres i de GABAerge nevronene, uten påvisbar uttrykk i DA-nevronene [23] , [55] . I tråd med Perrottis funn fant vi at uttrykket av FosB/ΔFosB i den posteriore/hale VTA økte etter kronisk etanoleksponering. Selv om vi ikke identifiserte celletypene der FosB/ΔFosB ble uttrykt i denne studien, spekulerer vi, basert på Perrottis funn beskrevet ovenfor, at FosB/ΔFosB kan uttrykkes i de GABAerge nevronene; selv om mekanismen for ΔFosB-induksjon utelukkende i delmengden av GABA-nevroner i posterior VTA fortsatt er uklar. Gitt at gjentatt administrering av en dopaminopptakshemmer induserte FosB/ΔFosB i VTA [23] , har det blitt foreslått at dopaminsystemet medierer ΔFosB-induksjon. Interessant nok reduserte seks dagers 100 Hz EA betydelig FosB/ΔFosB IR i posterior/tail VTA. Gitt at aktivering av KOR-er i VTA kan hyperpolarisere DA-nevroner og undertrykke dopaminfrigjøring ved direkte handlinger på frigjøringsstedet [56] , foreslår vi at ved aktivering av KOR-er kan flere økter med 100 Hz EA undertrykke dopaminfrigjøring, noe som fører til hemming av FosB/ΔFosB-ekspresjon i VTA GABA-nevroner [23] , selv om konsekvensen av GABA-nevronhemming krever ytterligere undersøkelse. Videre har nyere studier vist at KOR-er er funksjonelt uttrykt på PFC- og amygdala-, men ikke NAc-projiserende DA-nevroner i VTA [57] , [58] ; Dermed kan hemming av alkoholinntak indusert av flere økter med 100 Hz EA skyldes selektiv hemming av VTA-PFC- eller VTA-amygdala DA-kretsene eller begge deler via selektiv aktivering av KOR-er i VTA.
Oppsummert viser denne studien at flere økter med EA ved høy frekvens (100 Hz) ved akupunkt ST36 er effektive for å redusere (1) etanolforbruk og preferanse hos rotter som kronisk konsumerte høye mengder etanol, og (2) FosB/ΔFosB IR i belønningsrelaterte hjerneregioner. Gitt at ΔFosB og FosB er viktige medlemmer av Fos-familien av transkripsjonsfaktorer involvert i nevral plastisitet i narkotikaavhengighet, ser det ut til at ΔFosB og FosB i de belønningsrelaterte hjerneregionene er nøkkelspillere i EA-handling for å redusere overdreven alkoholforbruk.
Fotnoter
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at det ikke finnes noen konkurrerende interesser.