Kilde
Gruppe for cellulær og molekylær farmakologi, Institutt for farmakologi, University School of Medicine, Murcia, Spania.
Abstrakt
Kronisk bruk av rusmidler endrer det stressresponsive systemet dyptgående. Gjentatt eksponering for morfin fører til akkumulering av transkripsjonsfaktoren ΔFosB, spesielt i hjerneområder assosiert med belønning og stress. De vedvarende effektene av ΔFosB på målgener kan spille en viktig rolle i plastisiteten indusert av rusmidler. Nyere bevis tyder på at stressrelaterte hormoner (f.eks. glukokortikoider, GC) kan indusere tilpasninger i hjernens stresssystem som sannsynligvis involverer endringer i genuttrykk og transkripsjonsfaktorer. Denne studien undersøkte rollen til GC i reguleringen av FosB/ΔFosB i både hypothalamiske og ekstrahypothalamiske hjernestresssystemer under morfinavhengighet. For dette ble uttrykket av FosB/ΔFosB målt hos kontrollrotter (sham-opererte) og adrenalektomiserte (ADX) rotter som ble gjort opiatavhengige etter ti dager med morfinbehandling. Hos simulert opererte rotter ble FosB/ΔFosB indusert etter kronisk morfinadministrasjon i alle de undersøkte hjernestressområdene: nucleus accumbens (skall) (NAc), bed nucleus of the stria terminalis (BNST), sentral amygdala (CeA), hypothalamus paraventrikulær nucleus (PVN) og nucleus of the solitary tract noradrenergic cell group (NTS-A(2)). Adrenalektomi dempet den økte produksjonen av FosB/ΔFosB observert etter kronisk morfineksponering i NAc, CeA og NTS. Videre reduserte ADX uttrykket av FosB/ΔFosB i CRH-positive nevroner i BNST, PVN og CeA. Lignende resultater ble oppnådd i NTS-A(2) TH-positive nevroner og NAc pro-dynorfin-positive nevroner. Disse dataene antyder at nevroadaptasjon (estimert som akkumulering av FosB/ΔFosB) til opiater i hjerneområder assosiert med stress moduleres av GC, noe som støtter bevisene for en sammenheng mellom hjernestresshormoner og avhengighet.
Introduksjon
Opiater, som morfin, er effektive smertestillende midler som brukes til å behandle mange former for akutt og kronisk smerte. Alvorlige bivirkninger som toleranse og abstinenser bidrar imidlertid til opiatavhengighet og begrenser bruken av dem. Videre har den ikke-medisinske bruken av opiater (heroin, morfin) økt de siste årene. Økende bevis impliserer ulike mekanismer for genregulering (inkludert epigenetiske, molekylære, cellulære og kretsnivåeffekter) i endringene som rusmidler induserer i hjernen, noe som indikerer en potensiell terapeutisk strategi for avhengighetsbehandling [1] – [4].
Et sentralt spørsmål innen rusmisbruk har vært å identifisere proteiner som medierer overgangen fra akutte til langsiktige effekter av disse stoffene. Av spesiell interesse i studiet av avhengighet er Fos-familien av transkripsjonsfaktorer. Denne familien inkluderer c-Fos, Fra-1 og Fra-2, FosB og ΔFosB, en avkortet spleisningsvariant av fullengdes FosB [5] . I motsetning til andre medlemmer av Fos-familien induseres ΔFosB beskjedent i hjernen etter akutt medikamentadministrasjon, men på grunn av sin uvanlig lange halveringstid vedvarer den i uker, til og med måneder, etter at medikamentbruken er avsluttet. Som et resultat akkumuleres ΔFosB-nivåene gradvis ved gjentatt medikamenteksponering [6] , [7] , noe som tyder på at ΔFosB kan representere en mekanisme der misbruksmidler produserer varige endringer i genuttrykksmønsteret lenge etter at medikamentet er seponert [8].
Det har blitt rapportert at gjentatt eksponering for kokain, amfetamin, cannabinoider eller morfin fører til en økning i ΔFosB i hjerneområder relatert til de positive forsterkende effektene av rusmidler, som nucleus accumbens (NAc), prefrontal cortex og dorsal striatum. Denne økningen har blitt foreslått å være en nevroadaptasjon som fører til økt følsomhet for rusmidler og sårbarhet for å utvikle karakteristisk avhengighetsatferd [9] – [13] . Vi har nylig vist at økningen av FosB/ΔFosB-nivåer etter kronisk morfinadministrasjon ikke bare er begrenset til belønningssystemet, men også forekommer i hjernens stresssystem (som har vært relatert til de negative forsterkende effektene av rusmidler), så vel som i kjernen til den noradrenerge cellegruppen solitary tract-A2 (NTS-A2 , det viktigste noradrenerge systemet som innerverer stressnevrokretsløpet) [14] . I samsvar med disse funnene induserer flere former for kronisk stress også ΔFosB i NAc og andre hjerneområder [15] , [16].
Avhengighet er en kompleks lidelse fordi mange faktorer bidrar til utvikling og vedlikehold av denne nevrologiske lidelsen. Én faktor er stress, som har vært involvert i spesifikke aspekter ved rusavhengighet [17] – [21] . Både hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen (HPA, den primære endokrine stressveien) og det ekstrahypothalamiske stresssystemet (som omfatter den utvidede amygdalaen og NTS-A2 ) er dysregulert av kronisk administrering av legemidler med avhengighetspotensial [14] , [22] . I tillegg er HPA-akseresponsen lik etter både stressende stimuli og akutt eksponering for rusmidler [23] , [24] , med forhøyet frigjøring av kortikotropinfrigjørende hormon (CRH), adrenokortikotrop hormon (ACTH) og glukokortikoider (GC) . Denne responsen letter tilpasning til akutte miljøendringer, men kan også føre til atferdspatologier under kroniske stresstilstander, som avhengighet og depresjon [25] . Studier har ennå ikke undersøkt forholdet mellom GC og morfinavhengighetsindusert FosB/ΔFosB-induksjon i hjernens stresssystem. Vi vurderte derfor påvirkningen av GC på FosB/ΔFosB-ekspresjon etter kontinuerlig administrering av morfin i hjernestressrelaterte områder. For å besvare dette spørsmålet undersøkte vi først effektene av bilateral adrenalektomi (ADX) på FosB/ΔFosB-immunreaktivitet (IR) i hovedkjernene i stresssystemet hos morfinavhengige rotter.
Aktiviteten til hjernens stresssystem medieres av en rekke nevrotransmittere/nevromodulatorer. CRH er det viktigste nevropeptidet som regulerer stresssystemets aktivitet, og det har blitt postulert at det bidrar til både en eksisterende sårbarhet for avhengighetsskapende bruk av rusmidler og senere sårbarhet for tilbakefall [26] . I tillegg støtter rikelig med arbeid viktigheten av at NTS-A2 innerverer hjernens stresssystem ved rusavhengighet, og den sentrale rollen til noradrenalin (NA) som en nevrotransmitter som modulerer denne nevrokretsen [27] . Til slutt tyder betydelig bevis på at dynorfinekspresjon aktiveres i striatum og amygdala under akutt og kronisk legemiddeladministrasjon [28] . Gitt disse faktaene, var det følgende målet med denne studien å identifisere rollen til GC på FosB/ΔFosB-ekspresjon i spesifikke populasjoner av hjernens stresssystem under morfinavhengighet.
Resultater
Effekter av adrenalektomi på kroppsvektsøkning og plasma ACTH og kortikosteronkonsentrasjon hos morfinavhengige rotter
Før vi utførte immundeteksjonsanalysene, vurderte vi effekten av kronisk behandling med morfin. For dette formålet ble vekten av dyrene registrert på dagen for implantering av pellets og på avlivingsdagen (dag 10). Toveis ANOVA avslørte betydelige hovedeffekter på kroppsvektøkning for adrenalektomi [F(1,47)
=13.24, s=0.0007), morfinbehandling [F(1,47)=281.05, s<0.0001] og en interaksjon mellom ADX og morfinbehandling [F(1,47)=4.13, s=0.0479]. I samsvar med tidligere funn [29], [30], post hoc analyse indikerte at både sham- og ADX-grupper som ble gjort avhengige av morfin, viste en signifikant (p<0.001) lavere vektøkning (−13.75±5.0 g, n=12; 3.84±2.45 g, n=13, henholdsvis) enn det som ble observert hos sham- og ADX-dyr som fikk placebo-pellets (44.58±1.7 g, n)=12; 49.57±2.4 g, n=12), som har blitt tilskrevet det reduserte matinntaket observert hos disse dyrene [29].
For å sjekke effekten av adrenalektomien ble hormonkonsentrasjoner målt i plasma. Toveis ANOVA som undersøkte effekter av adrenalektomi og morfin på ACTH og kortikosteron plasmakonsentrasjon viste signifikante hovedeffekter av adrenalektomi [ACTH: F(1,18)=68.12, s<0.0001; kortikosteron: F(1,45)=10.42, s=0.0023). Som forventet, Newman's post hoc test viste (Fig. S1) det i placebo (n=6)- og morfin (n=4)-ADX rotter plasmakonsentrasjon av ACTH var høyere (s<0.001) sammenlignet med sham-opererte dyr for de to behandlingene som ble evaluert (placebo, n=6; og morfin, n=6). Ingen modifikasjoner ble observert i plasmakortikosteronkonsentrasjonen mellom ADX-placebo (n=14) og ADX-morfin (n=13) behandlede rotter. Konsentrasjonen av kortikosteron i ADX-morfinbehandlede rotter var signifikant (s<0.01) lavere enn de som sees i sham-morfin (n=10) behandlede rotter. Ingen signifikante endringer ble sett i sham-morfingruppen sammenlignet med sham-placebo (n=12).
Adrenalektomi demper differensielt morfinavhengighetsindusert FosB/ΔFosB i hjernestresssystemets underregioner
Hos kontrolldyr (placebo-implanterte rotter) ble svakt konstitutivt uttrykk av FosB/ΔFosB-IR identifisert i alle områdene av det stressrelaterte hjernesystemet. Kronisk morfinbehandling resulterte i utseendet av FosB/ΔFosB i alle hjerneområdene som ble undersøkt. I NAc(skallet) viste toveis ANOVA signifikante hovedeffekter av adrenalektomi [F(1,16)=6.44, s=0.0220] og kroniske morfinbehandlinger [F(1,16)=19.98, s=0.0004]. Newman-Keuls' post hoc-test viste (Fig. 2A–E) at det hos morfinbehandlede rotter var en signifikant (p<0.01) økning i FosB/ΔFosB-ekspresjon. Hos morfinavhengige ADX-rotter var det en signifikant (p<0.05) reduksjon i FosB/ΔFosB-proteinuttrykk i NAc. Toveis ANOVA for BNST viste signifikant hovedeffekt av kronisk morfinbehandling [F(1,16)=48.92, s<0.0001]. Post hoc-analyse avslørte en økning (s<0.001) i FosB/ΔFosB i både sham- og ADX-morfinavhengige dyr, noe som indikerer at regulering av FosB/ΔFosB var relatert til kronisk morfineksponering uavhengig av GC-konsentrasjon (Fig. 2F–J). Toveis ANOVA for FosB/ΔFosB i CeA viste signifikante effekter av adrenalektomi [F(1,15)=20.51, s=0.0004] og morfinforbehandling [F(1,15)=27.52, s<0.0001]. Post hoc test viste en signifikant økning (p<0.01) i FosB/ΔFosB-nivåer i sham-morfin-rotter versus sham-placebo-rotter, som ble svekket (p<0.01) i ADX-morfinavhengige gruppen (Fig. 2K–O). I tillegg viste ADX placebo-pelleterte rotter lavere nivåer (p<0.01) av FosB/ΔFosB enn den falske placebogruppen.
Toveis ANOVA som undersøkte effekten av adrenalektomi og morfin på FosB/ΔFosB-ekspresjon i PVN (parvocellulær underavdeling) viste signifikant effekt av morfinbehandling [F(1,16)=16.31, s<0.0001]. Post hoc analyse viste en signifikant (Fig. 3A–E) øke (s<0.05) i FosB/ΔFosB-IR i PVN fra både sham- og ADX-morfinbehandlede rotter. I NTS-A2 katekolaminerg cellegruppe, toveis ANOVA avslørte en hovedeffekt av morfinbehandling [F(1,11)=76.33, s<0.0001]. Post hoc analyse viste en signifikant (Fig. 3F–J) økning i FosB/ΔFosB-IR i sham-morfin-rottene sammenlignet med sham-placebo-gruppen (p<0.001), som ble svekket (p<0.05) i den ADX morfinavhengige gruppen.
Kronisk morfineksponering induserer FosB/ΔFosB-ekspresjon i CRH-nevroner i PVN, BNST og CeA. Påvirkning av glukokortikoider
Toveis ANOVA for FosB/ΔFosB-positive/CRH-positive nevroner i BNST viste hovedeffekten av adrenalektomi [F(1,20)=64.43, s<0.0001] og signifikant interaksjon mellom adrenalektomi og morfinbehandling [F(1,20)=6.80, s=0.0169]. I PVN avslørte toveis ANOVA signifikant hovedeffekt av adrenalektomi [F(1,19)=11.35, s=0.0032]. Toveis ANOVA for FosB/ΔFosB-positive/CRH-positive nevroner i CeA viste en signifikant hovedeffekt av adrenalektomi [F(1,20)=106.85, s<0.0001], morfinbehandling [F(1,20)=7.33, s=0.0136] og signifikant interaksjon mellom adrenalektomi og medikamentell forbehandling [F(1,20)=7.07, s=0.0151]. Tall 4, , 5,5, ,66 vis representative bilder av BNST-, PVN- og CeA-seksjoner fra sham- eller ADX-kontroller og morfinavhengige rotter. Post hoc analyse avslørte at et betydelig antall FosB/ΔFosB-positive nevroner ble funnet å uttrykke CRH i BNST (p<0.01; Fig. 4E), PVN (s<0.05; Fig. 6E) og CeA (s<0.01; Fig. 6E) i sham-morfin-rotter sammenlignet med sham-placebo-gruppen. I tillegg var antallet FosB/ΔFosB-positive nevroner som co-uttrykker CRH i ADX placebo-pelleterte rotter og i morfinavhengige rotter signifikant lavere i de tre kjernene sammenlignet med den tilsvarende behandlingen i sham-dyr, som vist i Tall 4, , 5,5, ,66 (BNST: s<0.01 vs. sham pluss placebo; s<0.001 vs. sham pluss morfin; PVN: s<0.05 vs. sham pluss placebo; s<0.001 vs. sham pluss morfin; CeA: s<0.001 vs. sham pluss placebo og vs sham pluss morfin).
På BNST-nivå viste toveis ANOVA for antall CRH-positive nevroner at det var en hovedeffekt av ADX [F(1,20)=103.92, p<0.0001] samt kronisk morfin [F(1,20)=4.35, p<0.05]. Som vist i Tabell 1, Newman–Keuls post hoc test viste at ADX placebo- og morfinpelleterte rotter viste lavere CRH-neuroner (p<0.001) enn de falske placebo- eller morfinavhengige gruppene. Ved PVN viste toveis ANOVA en signifikant effekt av adrenalektomi [F(1,19)=11.35, s=0.0032]. Toveis ANOVA for totale CRH-neuroner på CeA-nivå avslørte signifikante effekter av ADX [F(1,20)=240.09, p<0.0001] og hovedinteraksjon mellom ADX og kronisk morfin [F(1,20)=4.49, s=0.0467]. Tabell 1 viser at det var en signifikant reduksjon i CRH-neuroner ved CeA fra ADX placebo- eller morfinbehandlede rotter. Tabell 1 viser også at kronisk morfineksponering induserer en økning (p<0.05) av CRH-positive nevroner ved BNST- og CeA-nivåer.
Effekter av adrenalektomi på FosB/ΔFosB til DYN-positive nevroner i NAc (shell)
Vi observerte ingen signifikante endringer i antall pro-DYN-positive celler som co-uttrykker FosB/ΔFosB i NAc (skallet) etter kronisk morfineksponering (Fig. 7) angående placebogruppen. Toveis ANOVA for FosB/ΔFosB-positive/pro-DYN-positive nevroner i NAc(skallet) viste hovedeffekten av ADX [F(1,19)=10.11, s=0.0049]. Som vist i Fig. 7C, antallet FosB/ΔFosB-positive nevroner som co-uttrykker pro-DYN i ADX morfinavhengige rotter var signifikant (p<0.05) lavere med hensyn til tilsvarende behandling hos sham-dyr. Som vist i Tabell 1, ADX induserte ingen endringer i total pro-DYN-celle fra NAc(skallet).
Adrenalektomi hemmer morfinavhengighetsindusert FosB/ΔFosB til TH-positive nevroner i NTS-A2 Noradrenerge cellegruppe
Toveis ANOVA for FosB/ΔFosB-positive/TH-positive nevroner i NTS-A2 viste hovedeffekten av ADX [F(1,15)=64.86, s<0.0001], morfinbehandling [F(1,15)=29.62, s<0.0001], og signifikant interaksjon mellom adrenalektomi og morfinbehandling [F(1,15)=19.24, s=0.0005]. Newman-Keuls post hoc test indikerer at et betydelig antall FosB/ΔFosB-positive nevroner ble funnet å co-uttrykke TH i NTS (p<0.001; Fig. 7F) hos sham-morfin-rotter. I tillegg var antallet FosB/ΔFosB-positive nevroner som samtidig uttrykker TH i ADX morfinavhengige rotter betydelig lavere (p<0.001) sammenlignet med den tilsvarende behandlingen hos sham-dyr, som vist i Fig. 7F. På den annen side, som vist i Tabell 1, ADX induserte ingen endringer i totale TH-positive nevroner i NTS.
Diskusjon
De nåværende resultatene indikerte for første gang at hjerne-GC-signalering modulerte kronisk morfinadministrasjon-indusert FosB/ΔFosB-uttrykk i hjernestresssystemet på en regionspesifikk måte.
Konvergerte bevislinjer indikerer at stress øker risikoen for avhengighetsatferd [18] . Vedvarende stressende stimuli endrer syntese, uttrykk og signalering i stressrelaterte signalveier (f.eks. CRH, GC, NA, osv.). I tillegg påvirker misbruksstoffer stressbanene, noe som resulterer i endringer i genuttrykk, med signaleffekter på belønning og stressrelaterte molekyler [31] . Stress og misbrukte stoffer deler evnen til å utløse overlappende mønstre av nevronal aktivering i sentralnervesystemet, noe som resulterer i aktivering av umiddelbar genuttrykk.
Det har blitt grundig beskrevet at avhengighetsskapende stoffer og kronisk stressende stimuli øker uttrykket av transkripsjonsfaktoren ΔFosB i hovedkjernene som er involvert i deres positive forsterkende effekter [12] , [13] , [32] , [33] , og det har blitt foreslått at de vedvarende effektene av ΔFosB på målgener kan spille en viktig rolle i utviklingen av tilpasninger som karakteriserer avhengighet [9] , [34] . Imidlertid er det lite kjent om verken uttrykket av ΔFosB i hjernens stresssystem etter kronisk administrering av rusmidler eller de molekylære mekanismene for morfinfremkalt ΔFosB-akkumulering i stressrelaterte områder.
I denne studien undersøkte vi involveringen av GC på morfinindusert FosB/ΔFosB-ekspresjon i det hormonelle stresssystemet (HPA-aksen), som kontrolleres av CRH i PVN, så vel som i de ekstrahypothalamiske stresssystemene (som inkluderer den utvidede amygdalaen; [35] ), mediert av CRH og andre stressrelaterte systemer (inkludert NA og dynorfin; [19] ).
Vi viste nylig at kronisk morfinadministrasjon i syv dager økte FosB/ΔFosB-ekspresjon i den utvidede amygdalaen, PVN og NTS-A2 [ 14] . I samsvar med disse dataene viser nåværende resultater at kronisk morfinadministrasjon fremkaller en økning i FosB/ΔFosB i CeA, BNST og NAc(skall) så vel som i PVN og NTS-A2 . Den utvidede amygdalaen har vært assosiert med rusmiddelbelønning. Faktisk aktiverer alle større rusmidler dopaminerg overføring fra VTA til NAc(skall) og CeA. Denne aktiveringen og de påfølgende positive forsterkende effektene av rusmidler har vist seg å være relatert til GC-virkninger på GR lokalisert i VTA [28] . For å støtte denne hypotesen viser resultatene våre at FosB/ΔFosB-IR i NAc(skall) og CeA var svekket hos ADX-dyr, noe som kan indikere en krysstale mellom AP-1-transkripsjonsfaktorer og GR under morfinavhengighet [36] . I motsetning til de observerte effektene av ADX på FosB-ekspresjon i NAc og CeA, tyder nåværende resultater på at kronisk morfin økte Fos/ΔFosB-ekspresjon i PVN og BNST på en GC-uavhengig måte.
Flere nevrotransmittere i hjernestresssystemet, som CRH, NA og DYN, har vært relatert til de aversive tilstandene som er karakteristiske for avhengighetsprosessen [35], [37]-[39]. Nåværende funn viste at kronisk morfineksponering fremkalte en betydelig økning i Fos/ΔFosB-uttrykk i CRH-holdige nevroner i BNST, CeA og PVN. Fos-familien av transkripsjonsfaktorer kan virke på sykliske AMP-responselement (CRE)-steder [40]. Betydelig bevis indikerer at ΔFosB kan fungere som enten en transkripsjonsrepressor eller aktivator [40], [41]. GHvis CRH-genet har et CRE-motiv i promotorsekvensen, kan det foreslås at FosB/ΔFosB-akkumulering i CRH-neuroner kan mediere de morfininduserte endringene i CRH-nivåer, som rapportert for kokaineffekter [42], spesielt i CeA og BNST, hvor vi for første gang rapporterte en økning i antall CRH-positive nevroner under morfinavhengighet. Som støtte for denne hypotesen er en økning i CRH mRNA-nivåer beskrevet i CeA etter kronisk administrering av morfin [43]. Imidlertid var antallet CRH-positive nevroner uendret i PVN etter kronisk morfinbehandling. Disse resultatene er i samsvar med tidligere funn som viser at kronisk morfineksponering ikke induserer endringer i PVN CRH hnRNA [44]. Siden PVN CRH-uttrykk er nedregulert av GC [45], og gitt det nåværende arbeid og andre [29], [44] viste at kronisk opiateksponering ikke modifiserte kortikosteronfrigjøring, virker det logisk at kronisk morfinadministrasjon ikke endret antall CRH-celler.
Perifer administrering av kortikosteron øker CRH mRNA-ekspresjon i CeA og BNST [46] , [47] . I tillegg reduserte ADX CRH-ekspresjon i CeA [48] , [49] . Følgelig har vi observert at økningen i antall CRH-nevroner i BNST og CeA under morfinavhengighet ble opphevet etter adrenalektomi. Gitt at økningen av Fos/ΔFosB i CRH-nevroner under morfinavhengighet ble dempet hos ADX-dyr, kan det antydes en rolle for Fos/ΔFosB i reguleringen av CRH-ekspresjon av GC i den utvidede amygdalaen. På den annen side er det velkjent at GC negativt regulerer ekspresjonen av CRH-genet i PVN [45] . I samsvar med dette viste nåværende data tydelig at adrenalektomi opphevet økningen i Fos/ΔFosB-IR i CRH-holdige nevroner under morfinavhengighet i denne kjernen.
I denne studien avslørte immunkjemiske data at kronisk morfinbehandling betydelig økte farging for Fos/ΔFosB i NTS-A2, som ble redusert etter ADX. Da vi undersøkte de spesifikke nevrale populasjonene som uttrykte FosB/ΔFosB, fant vi en robust økning av Fos/ΔFosB-IR innenfor TH (det hastighetsbegrensende enzymet i katekolaminsyntese)-positive nevroner. NA har vist seg å spille en hovedrolle i avhengighet [50]. I tidligere arbeid fremkalte kronisk morfineksponering en økning i TH-nivåer i NTS-A2 [14], [29]. Det er kjent at TH-genet har et AP-1-sete i sin promoter [51]. Resultatene våre kan tyde på at FosB/ΔFosB er involvert i opiatindusert økning av TH-nivåer i NTS-A2. Noradrenerge cellegrupper i hjernestammen uttrykker høye nivåer av GC-reseptorer (GR). Det har vist seg at GC har en permissiv rolle i noradrenerg nevrotransmisjon [29], [30], [52]. Følgelig påvirket administrering av GR-antagonister flere aspekter av NA-aktivitet, inkludert TH-aktivering og neuronal aktivitet [30]. Nåværende resultater viste at etter ADX var det en nedgang i TH-positive celler som uttrykker FosB/ΔFosB i NTS-A2. Tatt i betraktning at adrenalektomi blokkerte økningen i TH-proteinnivåer i NTS-A2 under morfinavhengighet [29]og at et GRE/AP-1-sete er blitt beskrevet i TH-genpromotoren [53], kan dataene våre peke ut ΔFosB som en mediator i effekten av GC på noradrenerg aktivitet i NTS-A2 under opiatavhengighet.
DYN har blitt postulert som et mulig målgen for ΔFosB [54] , [55] . Resultatene våre viser at kronisk morfineksponering ikke signifikant endret FosB/ΔFosB-ekspresjon i pro-DYN-uttrykkende nevroner i NAc (skall ). Angående ΔFosB-regulering av DYN-ekspresjon, rapporterte Zachariou et al. [33] en liten, men signifikant reduksjon av DYN mRNA-nivåer i NAc fra ΔFosB-overuttrykkende mus, og postulerer dermed at denne transkripsjonsfaktoren hemmer DYN-ekspresjon. Ut fra dataene våre kan det ikke konkluderes med at kronisk morfin modifiserer DYN-ekspresjon gjennom FosB/ΔFosB-aktivitet, gitt at resultatene våre er oppnådd på proteinnivå.
Det har blitt postulert at DYN/kappa opioidsystemet ser ut til å indusere prodepressivlignende tilstander som involverer elementer av aversjon. Denne aversive responsen kan involvere gjensidige interaksjoner med NAc, DA og det ekstrahypothalamiske CRH-systemet [35] . Imidlertid er lite kjent om en mulig GC-regulering av DYN-ekspresjon i NAc. Det har blitt foreslått at ΔFosB i NAc, delvis gjennom undertrykkelse av DYN-ekspresjon, øker følsomheten for de givende effektene av morfin og kokain og fører til motstandskraft mot stress [9] , [33] . Våre data støtter en rolle for GC i å regulere de positive forsterkende effektene av morfin mediert av det mesokortikolimbiske DA-systemet, gitt at antallet FosB/ΔFosB/pro-DYN-positive nevroner avtar i NAc fra ADX-rotter. Disse effektene kan formidles direkte av GR, som er tilstede gjennom hele den mesolimbiske belønningsveien, eller indirekte via CRH-projeksjoner som oppstår fra CeA og/eller BNST til VTA og NAc, som er underaktiverte under morfinavhengighet hos ADX-rotter.
Oppsummert gir denne studien bevis for at GC er kritisk involvert i FosB/ΔFosB-akkumulering i hjernens stresssystemer etter kronisk morfineksponering, noe som kan føre til varige endringer i genuttrykksmønsteret i stressrelaterte områder. De nåværende funnene indikerer også at FosB/ΔFosB kan bidra til de GC-avhengige endringene i hjernens stresssystemplastisitet under opiatavhengighet. Ytterligere studier er nødvendige for å bestemme de intracellulære mekanismene som kroniske opiater induserer FosB/ΔFosB i utvalgte stressrelaterte regioner, samt mekanismen som er ansvarlig for undertrykkelsen av morfinindusert FosB/ΔFosB-ekspresjon av GC.
Metoder
Materialer
Kortikosteron og kolesterol ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA). Pellets av kortikosteron ble laget av Dr. Márton Vajna, (Apotekadministrasjonen, University of Pharmacy, Semmelweis University, Budapest, Ungarn). Pellets av morfinbase (Alcaliber Laboratories, Madrid, Spania) eller laktose (kontroll) ble fremstilt i Institutt for farmasi og farmasøytisk teknologi (Farmasøyskolen, Granada, Spania). Pentobarbital ble kjøpt fra Hospira (Hoofddorp, Nederland). Ketaminklorhydrat og xylazin ble kjøpt fra Labs. Merial (Lyon, Frankrike) og Labs. Calier (Barcelona, Spania), henholdsvis.
dyr
Sprague-Dawley hannrotter (220–240 g ved begynnelsen av forsøket; Harlan, Barcelona, Spania) ble holdt parvis i bur (lengde, 45 cm; bredde, 24 cm; høyde, 20 cm) ved ankomst i et rom med kontrollert temperatur (22±2°C) og fuktighetsgrad (50±10 %) og mat (12±08 vann) og mat. chow; Harlan Interfauna Ibérica, Barcelona, Spania). Dyrene ble tilpasset en standard 00 timers lys-mørke syklus (lys på: 20 t 00 min – 7 t 24 min) i 1986 dager før begynnelsen av eksperimentene. Alle kirurgiske og eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med EUs rådsdirektiv av 86. november 609 (300305440012/1201/EEC), og ble godkjent av de lokale komiteene for dyreforskning (REGA ES2005). Studien ble godkjent av Universitetet i Murcias bioetiske komité (RD 2009/07178) og Ministerio de Ciencia y Tecnología (SAF/FEDER XNUMX-XNUMX), Spania.
adrenalektomi
Rotter ble bilateralt adrenalektomisert, og en kortikosteronpellet ble implantert for å sikre lave, men stabile nivåer av GC [29] . Rotter ble bilateralt adrenalektomisert (ADX) via en dorsal tilnærming under 90 mg/kg ketaminklorhydrat og 8 mg/kg xylazin (ip) anestesi, og implantert subkutant (sc) med kortikosteronpellets med langsom frigivelse ved kirurgi. Sammensetningen av steroidpellets (25 mg kortikosteron pluss 75 mg kolesterol) ble valgt for å gi stabil kortikosteronkonsentrasjon tilsvarende døgnradisk nadir opptil 20 dager etter implantasjon [56] . ADX-rotter med kortikosteronerstatning (ADX pluss kortikosteron) viser ikke en utfordringsindusert økning av plasmakortikosteron [56] . Etter kirurgi hadde ADX pluss kortikosteron-rotter fritt valg om å drikke isotonisk saltvann (0.9 % NaCl) for å erstatte utarmet natrium sekundært til tap av aldosteron på grunn av adrenalektomi. Kontrollrottene ble utsatt for samme kirurgiske prosedyre (sham) uten binyreekstirpasjon. Simulerte rotter og rotter med ADX pluss kortikosteron fikk komme seg etter operasjonen i 5 dager før morfinavhengighetsprosedyren. Vellykket bilateral adrenalektomi ble bekreftet ved plasmakonsentrasjon av kortikosteron og ACTH og ved obduksjon av ADX-dyrene.
Medikamentell behandling og eksperimentell prosedyre
Fem dager etter operasjonen ble rottene implantert subkutant med to 75 mg morfinpellets under lett eterbedøvelse. Kontrollrottene fikk placebopellets som inneholdt laktose. Denne prosedyren har vist seg å produsere konsistente plasmakonsentrasjoner av morfin som begynner noen timer etter implantasjonen av pelletsene og et fullstendig abstinenssyndrom etter akutt injeksjon av opioidantagonister [57] . Avhengighet av morfin oppnås 24 timer etter implantasjonen av pellets og forblir konstant i 15 dager [58] . Ti dager etter implantasjonen av morfin- eller placebopellets ble rottene avlivet. De fire eksperimentelle betingelsene som ble undersøkt for HPA-akseaktivitet (plasmakonsentrasjon av kortikosteron og ACTH), FosB/ΔFosB-ekspresjon, CRH-ekspresjon, DYN-ekspresjon, TH-ekspresjon og FosB/ΔFosB-ekspresjon i CRH-, DYN- og TH-positive nevroner var: (i) sham-placebo; (ii) sham-morfin; (iii) ADX-placebo; (iv) ADX-morfin. Rottenes vektøkning ble kontrollert under behandlingen for å sikre at morfinet ble frigjort riktig fra pelletene, fordi det er kjent at langvarig morfinbehandling induserer en reduksjon i kroppsvektøkning forårsaket av lavere kaloriinntak [29].
Hjerneperfusjon og seksjonering
Rotter ble dypt bedøvet med en overdose pentobarbital (100 mg/kg ip) og perfusert transkardielt med saltvann, etterfulgt av fiksativ som inneholdt paraformaldehyd (4 % paraformaldehyd i 0.1 M boratbuffer, pH 9.5). Etter fjerning av de perfuserte hjernene ble de etterfiksert i samme fiksativ i 3 timer og lagret ved 4 °C i PBS som inneholdt 10 % sukrose inntil koronale snitt (30 µm tykkelse) ble kuttet rostrokaudalt på en frysemikrotom (Leica, Nussloch, Tyskland). Atlaset til Paxinos og Watson (2007) [59] ble brukt til å identifisere forskjellige hjerneområder hos rotter: NAc (skall), BNST, PVN, CeA og NTS-A2 ( figur 1 ). Snittene ble kryobeskyttet og lagret ved −20 °C inntil bruk.
FosB/ΔFosB immunhistokjemi
Seksjoner ble behandlet for immunhistokjemi som beskrevet av Núñez et al [29]. Kort fortalt, etter blokkering med 0.3 % H2O2 og 2 % normalt geiteserum (Sigma, USA) vevssnitt ble inkubert i primært anti-FosB/ΔFosB antiserum (kanin polyklonalt, #sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1![[forhold]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif)
1000). Det primære antistoffet brukt i denne studien skiller ikke mellom FosB og dens stabile spleisevariant ΔFosB. Gjentatt eksponering for FosB-induserende stimuli har vist seg å desensibilisere akutt FosB-induktivitet [15], [40], [60]. Derfor kan forskjeller mellom FosB/ΔFosB-farging hos morfinforbehandlede og ikke-forbehandlede rotter tolkes som primært å reflektere forskjeller i ΔFosB-akkumulering. Antigener ble visualisert ved hjelp av konvensjonell avidin-biotin-immunoperoksidase-protokoll (Vectastain ABC Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). 3,3'-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB; Sigma, USA)-reaksjonen ble intensivert med nikkel-ammoniumsulfat. Seksjoner ble montert på krom-alun gelatinbelagte objektglass, dehydrert og dekkglass.
Dobbeltmerkende immunhistokjemi av FosB/ΔFosB-immunoreaktive kjerner og CRH-, TH- og DYN-positive nevroner
For FosB/ΔFosB-TH-dobbeltmerking ble vevssnitt fra hver rotte i hver behandlingsgruppe behandlet for FosB/ΔFosB-immunreaktivitet ved bruk av DAB-nikkel-intensivering, og deretter ble TH avslørt ved bruk av kun DAB-kromogen. FosB/ΔFosB-immunfarging ble utført som beskrevet tidligere. Etter FosB/ΔFosB-farging ble seksjonene skylt i PBS, behandlet med 2 % normalt geiteserum og deretter inkubert over natten med det polyklonale kanin-anti-TH-antistoffet (AB152, Chemicon, USA; 16000) ved romtemperatur. De samme immunhistokjemi-prosedyrene beskrevet ovenfor ble fulgt. TH-antistoff-peroksidase-komplekset ble utviklet i DAB. Seksjonene ble montert på krom-alun gelatinbelagte objektglass og dekkglass.
For FosB/ΔFosB-CRH og FosB/ΔFosB-pro-DYN dobbeltmerking var prosessen den samme som beskrevet tidligere for FosB/ΔFosB-TH. For å påvise DYN-uttrykkende nevroner i NAc, ble en antigenhentingsprosedyre brukt ved å inkubere hjerneseksjoner i sitratbuffer (10 mM sitronsyre, 0.05 % Tween 20, pH 6.0) ved 60 °C i 20 minutter før blokkeringsprosedyren. Det primære anti-CRH-kanin-antiserumet ble levert av Wylie W. Vale (The Salk Institute, La Jolla, CA, USA), og ble brukt ved 1.500 fortynning i 72 timer ved 4°C. Det primære pro-DYN-antistoffet ble kjøpt fra Neuromics (# GP10110, Neuromics, Edina, MN, USA) og fortynnet 12000 (72 timer, 4°C).
Bildeanalyse
Bilder ble tatt med et Leica-mikroskop (DM 4000B; Leica) koblet til et videokamera (DFC290, Leica). FosB/ΔFosB-positive cellekjerner ble telt ved hjelp av et dataassistert bildeanalysesystem (QWIN, Leica). Grensene for NTS-A2 , BNST, CeA, NAc (skall) og den parvocellulære underavdelingen av PVN ble skissert, og antallet positive profiler ble registrert. Antallet FosB/ΔFosB-kjerneprofiler innenfor rammene av cellegruppene av interesse ble telt bilateralt i fire til fem seksjoner fra hver rotte og gjennomsnittet beregnet for å oppnå en enkelt verdi for hver rotte. For å unngå observatørskjevhet ble alle seksjoner kvantifisert av en blindet etterforsker. Totalt antall for forskjellige hjerneområder er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Kvantifisering av TH-, CRH- og DYN-positive celler og FosB/ΔFosB dobbeltfargede profiler
Positive kjerner for FosB/ΔFosB-immunreaktivitet ble påvist ved bruk av samme konvensjonelle lysmikroskopi beskrevet ovenfor, og telt ved x40 forstørrelse. FosB/ΔFosB-positive CRH-, TH- eller DYN-celler ble identifisert som celler med brune cytosoliske avleiringer for CRH-positiv, TH-positiv og DYN-positiv farging og blå/mørk kjernefarging for FosB/ΔFosB. Et kvadratisk felt (195 µm) ble lagt på bildet for å bruke som referanseområde. Antall dobbeltmerkede nevroner som ble observert bilateralt ble talt i fire til fem seksjoner fra hvert dyr i PVN, BNST og CeA for CRH-neuroner, NTS for TH-neuroner og NAc for DYN-neuroner. De CRH-, TH- og DYN-positive cellene uten en synlig kjerne (FosB/ΔFosB-negative CRH-, TH- eller DYN-celler) ble også inkludert i analysen.
radioimmunoassay
Blod ble samlet inn i iskjølte rør som inneholdt 5 % EDTA og deretter sentrifugert (500 g ; 4 °C; 15 min). Plasmaet ble separert, delt i to alikvoter og lagret ved −80 °C inntil det ble analysert for kortikosteron eller ACTH. Plasmakonsentrasjonen av kortikosteron og ACTH ble kvantifisert ved bruk av spesifikke kortikosteron- og ACTH-antistoffer for rotter ([ 125I ]-CORT og [ 125I ]-ACTH RIA; MP Biomedicals, Orangeburg, NY, USA). Analysens sensitivitet var 7.7 ng/ml for kortikosteron og 5.7 pg/ml for ACTH.
Statistisk analyse
Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM og ble analysert ved hjelp av statistikkpakken GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Dataene ble analysert ved toveis variansanalyse (ANOVA) med behandling (placebo, morfin) og kirurgi (sham, ADX) som uavhengige variabler. Newman–Keuls post hoc- test ble brukt til sammenligninger av individuelle grupper. Forskjeller med p < 0.05 ble ansett som signifikante.
støttende informasjon
Figur S1
Effekter av adrenalektomi (ADX) på plasmakonsentrasjoner av ACTH (A) og kortikosteron (B) hos kontrollpersoner og hos morfinbehandlede dyr. Kirurgisk ADX økte ACTH-nivåene både hos placebo- og morfinbehandlede rotter, mens den reduserte plasmakonsentrasjonen av kortikosteron hos morfinbehandlede rotter. Dataene representerer gjennomsnitt ± SEM av plasmanivåer av ACTH og kortikosteron hos rotter forbehandlet med placebo eller morfin i 10 dager. ***p < 0.001 versus sham-placebo; ++ p < 0.01, +++ p < 0.001 versus sham-morfin.
(TIF)
Erkjennelsene
Vi takker Dr. Márton Vajna og Anna Földes, fra Semmelweis University (Budapest, Ungarn) for klargjøring av kortikosteronpellets.